化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes),于1893年首次发现,原称化脓棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes),化脓放线菌(Actinomyces pyogenes),1997年pascual Ramos et.al将该菌从放线菌属中重新分类为隐秘杆菌属。化脓隐秘杆菌在隐秘杆菌属中致病性最强,同时也是一种条件性致病菌,化脓隐秘杆菌不仅感染牛羊猪等经济类动物,同时也会感染猫,狗,兔,狐狸,猴,鹅,鸭等其他动物。
化脓隐秘杆菌为革兰氏阳性菌种,且不易染色,具有多形性,多呈逗号状、弧形或者短杆状,无荚膜和芽孢,菌体着色不均,常散在,也有呈丛或2~4个并列排列。化脓隐秘杆菌的生长温度为20~40℃,其中最适宜生长温度为37℃。好氧或兼性好氧,在5%~10%CO2环境条件下或添加血液、血清可促进其生长。化脓隐秘杆菌在血琼脂培养基上培养24~48 h后可形成针尖状、表面光滑的、灰白色、直径1 mm的菌落,并且在菌落周围形成β-溶血环。
为了研究化脓隐秘杆菌的致病性,与免疫性,生长曲线与毒力测定是重要的实验数据,实验采用BHI液体培养基对化脓隐秘杆菌HJ-1进行培养,通过测定生长曲线对化脓隐秘杆菌HJ-1的生长规律进行了解,同时测定化脓隐秘杆菌HJ-1菌株对小鼠的半数致死量,为后续化脓隐秘杆菌的疫苗研发奠定基础。
化脓隐秘杆菌HJ-1型生长曲线的测定及细菌计数
将化脓隐秘杆菌HJ-1型纯培养后,取37℃恒温摇床培养48 h的化脓隐秘杆菌HJ-1型菌液,按1%的比例接种到30 mL 5%BHI液体培养基中,于37℃80 rpm恒温培摇床中培养,分别在培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h各时间点取菌液1 mL,并以5%BHI液体培养基为对照组测定其OD600值,每个时间点重复测定3次,取其平均值。
取培养至2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h时间点的化脓隐秘杆菌的菌液,做10倍比稀释,即取100μL菌液加入到900μL的生理盐水中,充分混匀后,从中取100μL加入到900μL的生理盐水中,充分混匀,依次稀释,使最终的稀释倍数为1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8,然后各取菌液100μL,均匀涂布到血液营养琼脂平板上,每个梯度重复3次,置于37℃恒温过夜培养,48 h后计数平板菌落数,有效计数为每个平板20~300个菌落。做细菌活体计数,观察化脓隐秘杆菌HJ-1型生长状况并绘制该菌株的生长曲线。
化脓隐秘杆菌HJ-1细菌计数及生长曲线的测定
根据(表1)显示表明:化脓隐秘杆菌HJ-1型在37℃恒温摇床培养0~4 h细菌生长缓慢从8 h开始细菌快速生长,12~14 h为化脓隐秘杆菌HJ-1型的对数生长期,生长至22 h细菌生长至高峰,此时的OD600值为0.81,菌落数为6.4×1011cfu(表2),之后化脓隐秘杆菌HJ-1型进入平台期(图1)。
表1化脓隐秘杆菌HJ-1生化鉴定结果
表2化脓隐秘杆菌细菌计数
化脓隐秘杆菌HJ-1型感染小鼠半数致死量测定
实验组前期已经测定,化脓隐秘杆菌HJ-1型感染小鼠最大致死量(Dm)为1.84×109cfu,逐步降低攻毒计量,直到测的小鼠未发生死亡的感染计量。并测定了该株化脓隐秘杆菌感染小鼠最低致死量(Dn)为1.53×108cfu,根据改进寇氏算法计算出化脓隐秘杆菌HJ-1感染小鼠的半数致死量,结果见(表3)。
表3化脓隐秘杆菌HJ-1型感染小鼠半数致死量测定
图1化脓隐秘杆菌HJ-1型生长曲线
根据公式:半数致死量公式logLD50=Xm-i(Σp-0.5)
测定HJ-1型化脓隐秘杆菌半数致死量为:4.16×108cfu
结论
测定了化脓隐秘杆菌HJ-1的生长曲线,确定其对数生长期为12~14 h,处于该时期的菌活力最强,感染能力最好,用对数生长期的化脓隐秘杆菌进行感染具有更好的致病性。测定了化脓隐秘杆菌HJ-1型对小鼠的半数致死量LD50=4.16×108cfu。试验结果为以后研究化脓隐秘杆菌的致病力与对动物的接种试验提供了依据。