低度酒主要包括果酒、黄酒、花酒等，是一种酒精含量低（一般在20%以下）的饮料酒，主要是利用谷物、水果、和鲜花为原料。由于其酒精含量低、品种繁多、营养价值高、消费者的喜好以及公众对严重的长期健康影响的严重关注，低酒精葡萄酒主要以现代生活方式为导向。近年来中国贵州省充分利用自身丰富的糯米、水果等农业资源，推动市场上的低度酒产品越来越多，对扩大消费空间具有重要意义。在低度酒的发酵过程中，风味是评价品质的最重要特征之一。酯类是影响风味的物质之一，由酵母发酵产生，是协调葡萄酒香气的关键因素。
但仍存在香气不显眼、酒质差、勾兑技术水平低等问题，导致低度酒行业发展缓慢。为了提高工业生产中低度酒的酯含量，人们通过添加产酯酵母、延长贮藏时间、优化工艺条件等方法，尝试使葡萄酒的香气特征多样化。然而这些方法会增加原料的损失，带来不良气味，降低葡萄酒的品质。目前，应用分子生物学技术构建高酯产率的酿酒酵母工程菌株已成为研究热点。乙醇乙酰转移酶（AAT）途径是酵母产生酯类代谢途径中最重要的途径，ATT基因的表达水平对乙酸的合成有显着影响。EAT1是一种新型AAT基因，是酯合成途径最后一端的关键限速酶，在酵母中催化乙酰辅酶A和乙醇生成乙酸乙酯。
本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码AAT的EAT基因构建重组质粒Yep-PEK，然后将Yep-PEK转化酿酒酵母W303-1A构建重组菌株W303-EAT。将重组菌株W303-EAT应用于低度酒发酵过程中，研究EAT基因对乙酸乙酯产生和香气产生特性的影响。该研究对未来低度酒酵母菌株的优化具有重要的参考价值。
将重组菌株W303-EAT及其亲本W303-1A在50 mL YPD培养基中以30°C和160 rpm预培养12 h，然后转移到含有重组菌株W303-EAT或其亲本W303的1 mL YPD培养基中-1A放入100 mL YPD培养基中，在30°C和160 rpm下培养24小时。使用Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪（每2小时测定一次光密度（OD 680）。
实验结果：研究表明重组菌株W303-EAT与其亲本W303-1A相比，在生长性能、CO 2损失、酒精含量和还原糖含量。生物信息学分析结果表明AAT蛋白是一种疏水性、分泌性和非跨膜蛋白。然后用低度发酵酒研究了重组菌株W303-EAT与其亲本菌株W303-1A在发酵性能和产香特性方面的差异。结果表明，用于发酵的重组菌株W303-EAT的米酒、蓝莓酒和玫瑰酒产生的乙酸乙酯比其亲本菌株W303-1A高。同时研究人员发现重组菌株W303-EAT发酵的米酒、蓝莓酒和玫瑰酒中异丁醇、异戊醇和苯乙醇的含量低于其亲本菌株W303-1A，表明重组菌株W303-EAT具有降低较高酒精含量的必然作用。
图1、重组质粒Yep-PEK的详细构建过程。
图2、W303-1A(A)和W303-EAT(B)的细胞显微形态。两株菌株均为卵圆形，呈典型的单细胞形态，无胞间连锁，细胞大小无明显差异，充分说明EAT基因的克隆和表达对其细胞形态无不良影响。
图3、重组菌株W303-EAT及其亲本W303-1A的生长曲线。如图所示，重组菌株W303-EAT的生长曲线与其亲本W303-1A相比略有差异，说明EAT基因的过表达对菌株的生长能力有特殊的影响。
图4、W303-1A和W303-EAT不同低度酒[玫瑰酒(A)、蓝莓酒(B)和黄酒(C)]中较高酒精含量的比较。星号（*）表示不同低度酒的酒精度较高，差异显著。从图中看出与W303-1A相比，重组菌株W303-EAT对低发酵葡萄酒中异丁醇、异戊醇和苯乙醇的含量降低有显著性差异（P<0.05），表明重组菌株W303-EAT具有具有特殊的还原高级醇的作用，对改善酒的风味具有重要意义。
图5、W303-1A和W303-EAT不同低酒精度葡萄酒[玫瑰酒(A)、蓝莓酒(B)和黄酒(C)]中乙酸乙酯含量的比较。星号（*）表示不同低度酒中乙酸乙酯含量。从图中可以看出重组菌株W303-EAT可以提高玫瑰酒、蓝莓酒、黄酒等低发酵酒发酵过程中乙酸乙酯的含量，对增强香气和增强酒香起到积极的作用，改善酒的风味。
总结：本研究采用同源重组原理构建了过表达乙醇乙酰转移酶（AAT）基因EAT的重组酿酒酵母菌株W303-EAT。结果表明重组菌株W303-EAT与其亲本W303-1A相比，在生长性能、CO2损失、酒精含量和还原糖含量。生物信息学分析结果表明AAT蛋白是一种疏水性、分泌性和非跨膜蛋白。然后用低度发酵酒研究了重组菌株W303-EAT与其亲本菌株W303-1A在发酵性能和产香特性方面的差异。结果表明用于发酵的重组菌株W303-EAT的米酒、蓝莓酒和玫瑰酒产生的乙酸乙酯比其亲本菌株W303-1A高。同时研究人员发现重组菌株W303-EAT发酵的米酒、蓝莓酒和玫瑰酒中异丁醇、异戊醇和苯乙醇的含量低于其亲本菌株W303-1A，表明重组菌株W303-EAT具有降低较高酒精含量的必然作用。本研究为研究过表达EAT基因的重组酿酒酵母W303-EAT的产香特性提供了新的思路。
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