苹果酸乳酸发酵(MLF)是一种由乳酸菌(LAB)将l-苹果酸转化为l-乳酸的生物过程，在大多数红酒和一些白葡萄酒中是非常可取的。这种转化导致葡萄酒的脱酸、微生物稳定和香气修饰。与酿酒酵母进行的酒精发酵(AF)不同，MLF是不确定的，可能由于恶劣环境，如低pH值、高乙醇和SO2。延长酿酒时间可能会降低酿酒厂的产量，并增加腐败微生物(尤其是酒香型酵母菌属)产生异味的风险。因此，高效可靠的MLF对葡萄酒的微生物稳定性和感官品质至关重要。在LAB物种中，葡萄酒酒球菌(Oenococcus oeniis)是在葡萄酒压力条件下最适应的物种，因此在MLF中占主导地位。酒酵素通过苹果酸和柠檬酸代谢产生乙酸、乳酸、乙酮和2,3-丁二醇，从而影响葡萄酒的香气。因此，选择酵母/细菌菌株对是确保高效和可靠的MLF的关键。在过去的几十年里，人们对改善葡萄酒香气的复杂性越来越感兴趣，越来越多地使用非酿酒酵母作为发酵剂来进行AF。研究发现，芽孢杆菌对共接种菌体中葡萄酒酒球菌的生长和活性有积极作用。在混合发酵中，非酵母菌可以刺激、抑制或不影响MLF，这取决于菌株和接种时机。因此，更深入地了解在同时和连续接种酵母发酵剂培养过程中，葡萄酒酒球菌的活力和香气结果对管理MLF是非常必要的。
本研究旨在探讨两个关键因素（接种时间和配对酵母）对梅洛葡萄酒发酵性能和香气产生的影响。对发酵活性和微生物生长进行了监测。测定了最终葡萄酒的非挥发物、挥发物和香气特征。此外，研究了接种时间和酵母配对两种试验因素及其相互作用对葡萄酒酒球菌生长和香气产生的影响。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
为了模拟梅洛必须发酵的应激条件葡萄酒酒球菌SD-2a分别在酸胁迫(pH值3.5无乙醇)和乙醇胁迫(pH值4.8 12%v/v乙醇)的ATB肉汤中培养。使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪(FP-1100-C,Finland)在线监测OD600 nm下细菌的生长动力学。将微生物(OD600 nm=1.0)接种到接种量为2%v/v的胁迫ATB培养液中，转移到多孔板(400μL)，在28°C下培养56 h。每2 h测量一次OD600 nm值，每个试验进行5个重复。
实验结果
接种时机和配对酵母对梅洛葡萄酒发酵过程中葡萄酒酒球菌SD-2a、酿酒酵母F5和发酵酵母H5Y-28的发酵效果有显著影响。共同接种使高效酿酒可能是由于较低的乙醇胁迫，而顺序接种获得了与酵母和葡萄衍生挥发物相关的更大的香气结果。总酿酒时间由接种时间决定，而不是由配对酵母决定。然而发酵性丝孢酵母的存在，无论是活的还是死的，都刺激了葡萄酒酒球菌SD-2a的生长，这表明它是诱导可靠的葡萄酒MLF的潜在候选人。需要进一步的研究以阐明代谢产物(如甘露糖蛋白)，发酵性丝孢酵母H5Y-28促进了葡萄酒酒球菌的活力和MLF活性。此外，为了确定所观察到的影响是菌株特异性的还是种特异性的，应该进一步研究广泛的发酵假单胞菌菌株。
图1、发酵动力学实验。(A)AF期间的糖消耗:co-OS和co-OSP分别等于se-OS和se-OSP。(B)co-OS、co-OSP同步发酵和(C)se-OS、se-OSP顺序发酵中的苹果酸(实线)和乳酸(虚线)浓度。
图2、微生物的增长。(A)在AF期间酿酒酵母(实线)和发酵性丝孢酵母(虚线)。(B)在AF和MLF期间葡萄酒酒球菌SD-2a。(C)葡萄酒酒球菌SD-2a在pH 3.4和12%v/v乙醇下。
图3、梅洛葡萄酒中与O.oeni代谢相关的主要有机酸的浓度。(A)苹果酸和柠檬酸。(B)乳酸和乙酸。
图4、从MLF中提取的梅洛葡萄酒挥发物的热图和层次聚类分析。*香气活性挥发性物质(浓度超过香气阈值的挥发性物质)。
图5、梅洛葡萄酒的香气特征和MF值。
总结
人们对开发葡萄酒球菌和酿酒酵母菌/非酿酒酵母菌的共接种物，用于葡萄酒的苹果乳酸发酵(MLF)和酒精发酵(AF)越来越感兴趣。本研究借助Bioscreen全自动生长曲线分析仪，阐明两个关键因素(接种时机和酵母配对)对梅洛葡萄酒发酵性能和香气产生的影响。
用于MLF的葡萄酒酒球菌与用于AF的两种酵母培养物(即单一酿酒酵母和混合酿酒酵母/发酵毕赤酵母H5Y-28同时或顺序接种。接种时间决定了总体酿酒时间，并影响了主要高等醇、萜和葡萄酒酒球菌介导的挥发物的产生。与之相比，配对酵母菌提高了大头翁的活力，对芳香酯类和挥发性脂肪酸有显著影响。可能是由于较低的乙醇胁迫，共接种允许葡萄酒酒球菌在AF（酒精发酵）期间启动MLF，导致总发酵时间减少45%。与此同时，发酵性丝孢酵母促进了葡萄酒酒球菌的生长，其最大数量是无发酵型丝孢酵母共发酵的1.7倍。这种对葡萄酒酒球菌生长的刺激也发生在连续发酵中，发酵性丝孢酵母被酿酒酵母取代。只有在顺序接种条件下，发酵假单胞菌能诱导高水平的3-甲基乙酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，从而增强葡萄酒的鲜果性。这些结果表明，发酵发酵毕赤酵母H5Y-28对葡萄酒球菌和MLF有积极作用。本研究提供了一种利用友好的非酵母菌和适当的接种策略来提高葡萄酒MLF和香气结果的替代方法。