近年来,随着经济的高速发展,人民生活水平不断提高。我国民众的饮食结构发生了很大的改变,过多地摄入高热量、高脂质的食物,导致高血脂、高血压、冠心病等“富贵病”发病率显著增加。目前,临床上治疗该类疾病的主要是他汀类药物,最重要的是洛伐他汀。洛伐他汀(Lovastatin)是一类在临床上应用广泛的降血脂、降胆固醇药物,作为体内羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的结构类似物,能竞争性抑制HMG-CoA的代谢,减少机体内胆固醇的生成,从而对高血压和冠心病等疾病起到积极的防治作用。当前,洛伐他汀主要是通过微生物发酵生产,在微生物发酵中,优良的菌种是获得生产成功的关键。诱变育种是获得高产菌株的简便有效的手段在微生物育种中被广泛应用。课题组采用多种诱变剂对洛伐他汀产生菌株红曲霉进行处理,以期获得稳定高产菌株,为进一步开发功能性红曲提供理论依据。


三种诱变剂致线曲线与分析


红曲霉菌株对UV、DES均比较敏感,致死率与诱变剂剂量呈正相关。当UV照射时间为120s时,致死率为72.1%。DES浓度为4%时,致死率为74.6%。由图2可知,在实验剂量范围内,红曲霉对HNO2不敏感,致死率低且变化不明显,因此,不宜选HNO2作为红曲霉的诱变剂。


UV诱变结果


从筛选平板上挑取抑菌圈直径D≥1.48cm的10株菌株孢子,置于温度为32℃、转速为160 r/min摇床上发酵7d,测洛伐他汀产量。


在所得到的10株突变株中,抑菌圈直径比原始菌株均有不同程度的增加,但洛伐他汀的产量则有高有低,总的来看大部分菌株的产量是提高的,即发生了正向突变,如UV-5、UV-10;而有少部分菌株的产量不升反降,如:UV-6、UV-9。其中UV-5的产量最高,达到了0.239mg/mL,相对于出发菌株提高了42.3%。说明出发菌株(Monascus sp.)对紫外线敏感,采用紫外线单因素处理即可得到较理想的诱变效果。

HNO2诱变结果


经亚硝酸诱变后,通过初筛选择9株抑菌圈直径D≥1.42cm的突变株,置于温度为32℃、转速为160 r/min摇床上发酵7d,测洛伐他汀产量。所得结果见表2。由表2可知,经亚硝酸诱变后,红曲霉对粗糙脉胞菌抑菌圈直径及洛伐他汀产量变化幅度均较小。在所得的9株红曲霉突变株中,抑菌圈变化范围1.42~1.76cm之间,洛伐他汀产量最高是HN-4、HN-8菌株,均为0.184mg/mL,比出发菌株的产量提高不到10%,说明该红曲霉对亚硝酸不大敏感,这与致线曲线分析是一致的。


DES诱变结果


经硫酸二乙酯诱变后,通过初筛选择10株抑菌圈直径D≥1.52cm的突变株,置于温度为32℃、转速为160r/min摇床上发酵7d,测洛伐他汀产量。


筛选所得到的10株突变株中,大部分菌株发生了正向突变,产量均有不同程度提高,其中洛伐他汀产量最高的菌株为DE-8,达到了0.223mg/mL,增幅为32.7%。说明该红曲霉对DES较为敏感,应用DES对其进行诱变育种能得到较理想的效果。但从洛伐他汀产量的提高幅度来看,DES的诱变效果不如UV好。可能的原因是此两种诱变剂的诱变机理不相同所造成的,UV能诱发DNA形成胸腺嘧啶二聚体,导致复制中发生错配而引起突变;而DES能与DNA中碱基发生化学反应,使碱基结构发生变化,导致碱基配对的转换或颠换,从而引起突变。


实验结果表明:3种诱变剂对Monascus sp.的诱变效果有较大差异,其中紫外线诱变效果最好,硫酸二乙酯次之,亚硝酸最差。


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