深海（水深超过1000米）生物圈是地球上最大的生态系统之一，孕育着多种生命形式。估计那里存在超过1029个微生物细胞。此外，每天伴随着海雪、鲸落和洋流，大量微生物从表层海水被动迁移到深海水中。这些微生物的迁移伴随着压力的增加和温度的降低。深海具有高压、低温、黑暗等极端环境特性，曾被认为是生命的禁区，但近些年发现深海生存着大量的微生物资源，形成了独特的深海生态系统。高静水压力（HHP）对微生物细胞的许多生理活动有很大的抑制作用，例如膜流动性、RNA合成、运动性、营养吸收、细胞分裂、蛋白质合成和复制。生活在深海的微生物类群必须能够耐受深海高静水压。到目前为止，虽然已经揭示了深海微生物适应高压环境的一些策略，例如增加细胞膜的流动性，调整细胞代谢途径等，但是至今没有发现和鉴定出深海微生物耐压相关的功能基因和代谢机制。
三甲胺(TMA)和三甲胺N-氧化物(TMAO)是广泛分布在海洋中的含氮有机化合物。描述了TMAO在海洋微生物中的两个功能。TMAO被α-变形菌的SAR11进化枝和海洋玫瑰杆菌进化枝用作氮源。Myroides profundi D25 T是拟杆菌门的成员，从冲绳海槽南部的深海沉积物（水深1245米）中分离出来。研究发现菌株D25是一种耐压细菌，它使用TMAO作为压电电解质来应对HHP应激。菌株D25通过TMA转运蛋白TmaT吸收TMA，然后使用TMA单加氧酶(Mp Tmm)将TMA氧化成TMAO。由此产生的细胞内TMAO的积累能够在高压下生长。本研究揭示了TMA/TMAO在海洋细菌中的新功能，并提供了独特的代谢途径与深海细菌中HHP适应之间的直接联系。
芬兰Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
使用含有3%(m/v)人造海盐、维生素复合物、1 mM TMA或TMAO、10 mM葡萄糖、0.2 mM Na3PO4、10 mM Hepes和5μM FeCl3(36)的确定培养基测试菌株D25和DSS-3是否可以使用TMA或TMAO作为氮源。使用自动生长曲线分析仪（Bioscreen）记录在25°C培养的两种菌株的生长情况。
实验结果：TMAO是一种蛋白质稳定剂，可以抵消HHP对海洋动物的影响。研究发现菌株D25是一种耐压细菌，它使用TMAO作为压电电解质来应对HHP应激。菌株D25通过TMA转运蛋白TmaT吸收TMA，然后使用TMA单加氧酶(Mp Tmm)将TMA氧化成TMAO。由此产生的细胞内TMAO的积累能够在高压下生长。TMA的存在还改善了拟杆菌门中其他细菌的生长，这些细菌在HHP下含有编码TmaT和Mp Tmm同源物的基因，表明这可能是深海拟杆菌门采用的常见策略。揭示了TMA/TMAO在海洋细菌中的新功能，并提供了独特的代谢途径与深海细菌中HHP适应之间的直接联系。
图1、(A)以TMA或TMAO为唯一氮源培养的菌株D25和DSS-3的生长曲线。(B)D25菌株在初始TMA浓度为85μM的2216E培养基中培养的TMA和胞内TMA和TMAO浓度的变化。(C)应变D25菌株在4°C下在0.1、20和40 MPa下添加或不添加10μM TMA的生长曲线。(D)10μM TMAO或TMA对菌株D25在不同压力下生长和存活的影响。孵育开始（开始）时的细胞数约为1×10 6CFU/毫升。将培养物在4°C下培养10天，然后计算CFU并与起始培养物的CFU进行比较。红线是指培养物中细胞的完全死亡对照。在没有TMAO或TMA的情况下培养的菌株D25。(E)D25菌株在不同压力下添加或不添加10μM TMA的形态学观察。
图2、(A)重组Mp Tmm在4°和25°C下氧化TMA的非线性拟合曲线。(B)不同浓度TMA对D25菌株Mptmm基因表达的影响。菌株D25在有或没有TMA的2216E培养基中培养1小时。(C)静水压力对D25菌株Mptmm基因表达的影响。菌株D25在2216E培养基中在大气压、20或40 MPa下培养1小时。(D)Mp Tmm和Rn Tmm的结构比较。Mp Tmm为黄色，Rn Tmm为紫色。(E)Mp Tmm和Rn Tmm晶体结构中NADP+(左)和FAD(右)位置的比较。FAD和NADP+分子显示为Mp Tmm为黄色和Rn Tmm为紫色的棒。(F)温度对Mp Tmm活性的影响。(G)DSC测量Mp Tmm的T m值。(H)分别在25°和4°C测量不同压力下的酶活性。
图3、TmaT的表征。(A)实时定量PCR检测静水压力对菌株D25基因tmaT表达的影响。菌株D25在2216E培养基中在大气压、20或40 MPa下培养1小时。误差条代表来自三次实验的SD。（B到E）将TMA或TMAO滴定为TmaT的ITC曲线。显示了ITC迹线（顶部）和综合结合等温线（底部）。滴定底物和温度如图所示。(F)TmaT及其与其他BCCT转运蛋白的同源物的分子系统发育分析。序列来自IMG/JGI数据库。BetP、BetT和CaiT分别是甘氨酸甜菜碱、胆碱和肉碱的BCCT转运蛋白。
图4、TMA等季胺对菌株D25在高温高压下生长的影响。a）不同浓度的TMA对菌株D25在20 MPa下生长的影响。培养基由3%人工海盐、0.05%蛋白胨、0.01%酵母粉和不同浓度的TMA组成。培养物在25℃下培养2天。b）不同压力下季胺对菌株D25生长的影响。培养基中添加3%人工海盐、0.05%蛋白胨、0.01%酵母粉和20μM季胺。培养物在25℃下培养2天。控制，不含季胺。误差条表示三次重复实验的标准差。
图5、TmaT和Mp Tmm在重组大肠杆菌DH5α、大肠杆菌突变体Δtor CAD和枯草芽孢杆菌168中的体内功能。(A,C,和D)TmaT和Mp Tmm的表达对大肠杆菌DH5α(A)、Δtor CAD(C)和B.subtilis 168(D)在不同压力下48小时培养的生长和存活的影响。孵育开始（开始）时的细胞数约为1×105 CFU/毫升。将菌株在25°C下培养48小时，加入或不加入20μM TMA，然后计数CFU并与起始培养物（结束/开始）进行比较。(B)Δtor CAD共表达TmaT和Mp Tmm的细胞在25°C不同压力下加或不加20μM TMA培养48小时的形态学观察。
总结：本研究以深海细菌Myroides profundi D25为研究对象，发现该菌株能够利用三甲胺（TMA）转运载体TmaT吸收深海环境中的TMA，在细菌胞内诱导表达三甲胺单加氧酶MpTmm，将TMA氧化为氧化三甲胺（TMAO），并在胞内累积。在深海高压下，TMAO能够保护蛋白质等生物大分子，使其维持正常的构象，发挥生物学功能，从而使得D25菌株具有耐受深海高静水压的能力，维持生存和生长。将TmaT-MpTmm蛋白在大肠杆菌和枯草杆菌菌株中表达，可显著提高大肠杆菌和枯草杆菌菌株的耐压能力。生物信息学分析表明TmaT和MpTmm同源蛋白在海洋细菌，尤其是拟杆菌门细菌中广泛分布，表明这可能是深海细菌普遍采用一种耐压策略，具有重要理论意义。
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