棒杆菌属细菌由于具有生物安全(美国FDA认证)、生长速度快、营养需求低、底物谱广等优势，被认为是生物发酵产业的理想工业底盘菌株，广泛应用于氨基酸和有机酸等化学品的工业化生产，尤其是在赖氨酸、谷氨酸等氨基酸的发酵生产中占据主导地位。多年来现有技术对棒杆菌属菌株进行了大量的研究和遗传改造，包括氨基酸合成途径、底物利用途径、增强氨基酸外排等的改造，已经获得了较高水平的产氨基酸的棒杆菌属工程菌株。目前，多种氨基酸的工业发酵水平超过100g/L，赖氨酸的工业发酵水平超过200g/L(Xu,J.Z.,et al.,Microb Cell Fact,2020,19,39；户红通等,中国酿造,2018,37(10),51-56)。
然而，在发酵过程中，高浓度赖氨酸、谷氨酸等发酵产物的积累以及底物的不断流加均对棒杆菌细胞造成极高的渗透压，高渗透压也几乎是所有高水平工业菌株在发酵后期都会面临的环境胁迫(Varela C et al.Applied Microbiology And Biotechnology2003,60(5):547-555)，直接影响细胞的膨胀度、完整性、水合程度和分子拥挤程度等，从而干扰细胞的生长代谢，成为影响终产物合成效率的关键因素，限制了工业菌株发酵水平的进一步提升。增强棒杆菌属菌株对高渗透压的耐受能力，是提高发酵产物终浓度，提升生物发酵经济性的有效手段。但是，现有技术中，由于缺乏高通量的功能基因鉴定方法，目前，已经挖掘到的棒杆菌来源的渗透压耐受性功能基因极少，从而限制了棒杆菌发酵性能的进一步提升。
为克服现有技术中的问题，技术人员首先构建了一种基于谷氨酸棒杆菌全基因组单基因过表达库的功能基因的高通量筛选方法，用于高通量快速地筛选能提高菌株对高渗透压力的耐受性的功能基因，从而提升菌株的氨基酸产量。在此基础上完成本发明。
赖氨酸高渗透压条件过表达提高生长基因的初筛
构建的C.glutamicum ATCC13032全基因组单基因过表达库，共计3000多个菌株，分别进行赖氨酸高渗透压条件的生长初筛。种子和高渗透压培养均采用Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪进行培养和测定OD600。种子培养如下：将C.glutamicum ATCC13032全基因组单基因过表达库的过表达菌株与对照菌株C.glutamicum ATCC13032(pEC-0)分别接种到含有25μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基中，培养体系为48孔板，装液400μL，30℃培养8h。
取10μL培养好的种子液，分别转接到赖氨酸高渗培养基中，培养体系为48孔板，装液400μL，培养基含有0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，30℃，800rpm培养96-106h，设置每隔1h测定OD600，全面筛选过表达可以提高以上高渗透压条件细胞生长的基因。高渗培养基成分为(g/L)：(NH4)2SO4，20g/L；尿素，5g/L；KH2PO4，1g/L；K2HPO4·3H2O，1.3g/L；MOPS，42g/L；CaCl2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；ZnSO4·7H2O，0.001g/L；CuSO4，0.0002g/L；NiCl·6H2O，0.00002g/L；gSO4·7H2O，.25g/L；原儿茶酸，0.03g/L；VB1，0.0001g/L；生物素，0.0002g/L；酵母粉，2g/L；葡萄糖，40g/L；赖氨酸，175g/L；H2SO4调节pH 7.1-7.2。所有过表达菌株的每个时间点OD600分别与对照菌株计算比值，归一化处理所有批次数据，再计算30h至终点生长过程连续15个最大值的平均值，然后将15个值均提高或降低20％以上的基因判定为生长提高或降低基因。
所有基因均显示了30h至终点生长过程连续15个最大值的平均值，其中最上面的深色点是15个值均提高20％以上的基因，下面的深色点代表15个值均降低20％以上的基因。生长提高的基因一共29个，包括以下基因cgl0011、cgl0063、cgl0470、cgl0487、cgl0489、cgl0490、cgl0893、cgl0917、cgl0923、cgl1010、cgl1118、cgl1367、cgl1472、cgl1532、cgl1541、cgl1605、cgl1653、cgl1941、cgl1994、cgl2392、cgl2496、cgl2610、cgl2735、cgl2806、cgl2937、cgl2911、cgl2998、cgl3003、cgl3098。
赖氨酸高渗透压生长提高基因的复筛
将初筛所得到的29个生长提高的基因，进行赖氨酸高渗透压和非高渗透压的复筛。将初筛所得到的29个基因的过表达菌株和C.glutamicum ATCC13032(pEC-0)对照菌株，分别接种至含有25μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基中，培养体系为48孔板，装液400μL，30℃培养8h。按照初始OD600
为0.1分别转接至非高渗和高渗培养基中，培养体系为48孔板装液400μL，添加0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，30℃，800rpm培养96h至106h，每2h检测一次OD600，实验设置三个平行。依然使用Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪进行培养和测定OD600。
高渗培养基成分为(g/L)：(NH4)2SO4，20g/L；尿素，5g/L；KH2PO4，1g/L；K2HPO4·3H2O，1.3g/L；MOPS，42g/L；CaCl2，0.01g/L；FeSO4·7H2O，0.01g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；ZnSO4·7H2O，0.001g/L；CuSO4，0.0002g/L；NiCl·6H2O，0.00002g/L；MgSO4·7H2O，0.25g/L；原儿茶酸，0.03g/L；VB1，0.0001g/L；生物素，0.0002g/L；酵母粉，2g/L；葡萄糖，40g/L；赖氨酸，175g/L；H2SO4调节pH 7.1-7.2之间。非高渗培养基为在上述高渗培养基不添加赖氨酸。所有菌株的3个平行样品每个时间点OD600分别计算平均值和标准偏差，绘制每个菌株非高渗和高渗条件的生长曲线。再分析30h至终点生长过程每个时间点样品过表达菌株与对照菌株OD600
差异显著性(T-test分析)，如果满足高渗条件连续15个时间点及以上是P＆lt;0.05，且这些点的过表达菌株OD600
平均值均大于对照菌株，则该基因过表达可以提高赖氨酸高渗条件的菌株生长。初筛获得的29个基因，复筛后只有15个基因满足以上要求，非高渗和高渗条件的生长曲线如图1所示，可以看出cgl0063、cgl0470、cgl0917、cgl0923、cgl1010、cgl1118、cgl1472、cgl1994、cgl2392、cgl2496、cgl2610、cgl2806、cgl2911、cgl2998和cgl3003仍然是在高渗条件提高菌株生长；同时发现cgl3003的过表达不仅可以提高菌株在高渗条件下的生长，也可以提高菌株在非高渗条件的生长；其它基因过表达只在高渗条件下提高菌株的生长。在赖氨酸高渗条件，满足上述标准的基因在生长提高阶段时间点中最大提高幅度如下：cgl0063在68h最大可提高16％，cgl0470在72h最大可提高24％，cgl0917在66h最大可提高18％，cgl0923在72h最大可提高14％，cgl1010在72h最大可提高36％，cgl1118在42h最大可提高52％，cgl1472在72h最大可提高33％，cgl1994在96h最大可提高16％，cgl2392在72h最大可提高25％，cgl2496在90h最大可提高43％，cgl2610在90h最大可提高51％，cgl2806在90h最大可提高53％，cgl2911在103h最大可提高28％，cgl2998在104h最大可提高36％，cgl3003在60h最大可提高23％。
图1.赖氨酸高渗透压耐受基因的复筛结果；
图2赖氨酸高渗透压耐受基因在硫酸钠高渗条件下的生长
15个耐高渗基因对硫酸钠渗透压耐受性的验证
将复筛所获得的15个的基因过表达菌株和ATCC13032(pEC-0)对照菌株分别接种至含有25μg/mL卡那霉素的TSB液体培养基中，30℃培养8h，按照初始OD600
为0.1分别转接硫酸钠高渗培养基中，培养体系为48孔板装液400μL每孔含有0.04mM的IPTG和25μg/mL卡那抗生素，使用Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪30℃800rpm培养96h至120h，每2h检测OD600，实验三个平行，全面表征15个基因在谷氨酸棒杆菌高渗透压力响应与耐受中的功能。高渗培养基为在非高渗培养基中添加156g/L硫酸钠。检测结果如图2所示，采用相同的标准进行数据分析，发现15个基因在硫酸钠高渗条件下也能提高生长。以上结果表明，复筛所得到的15个基因过表达对于提高谷氨酸棒杆菌的高渗透压耐受性具有有益效果。在硫酸钠高渗条件下，生长提高阶段中，cgl0063在64h最大可提高25％，cgl0470在118h最大可提高40％，cgl0917在50h最大可提高37％，cgl0923在26h最大可提高44％，cgl1010在26h最大可提高46％，cgl1118在60h最大可提高11％，cgl1472在26h最大可提高36％，cgl1994在118h最大可提高20％，cgl2392在26h最大可提高63％，cgl2496在h最大可提高60％，cgl2610在26h最大可提高52％，cgl2806在26h最大可提高28％，cgl2911在26h最大可提高87％，cgl2998在26h最大可提高83％，cgl3003在26h最大可提高92％。
总结：通过对谷氨酸棒杆菌中的15种提高微生物渗透压耐受性功能基因的过表达，发现其可以提高菌株对于高渗透压力的耐受性，促进出发菌株生长，从而提升菌株的氨基酸产量。
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