腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）属于革兰氏阴性菌，适宜低温下生长，能产生H2S、TMA、CH4SH和（CH3）2S等挥发性物质，腐败潜力强，被确认为有氧冷藏海水鱼的特定腐败菌（Specific spoilage organisms，SSO）。研究者针对水产品腐败希瓦氏菌生态特性、生长动力学、货架期预测、靶向抑制和抑菌机制等进行了探究，研究了环境因子对大黄鱼腐败希瓦氏菌生长影响的计数法。研究了复合生物保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌机理。水产品在加工、销售、流通和贮藏过程中微生物受内在和外在因子的影响，特别在运输过程中温度易产生波动，多因子交互作用下可能产生拮抗和协同作用。
通过设置“抑菌栅栏”和改变栅栏强度达到抑制微生物的作用。采用微生物生长／非生长（Growth/no growth，N/NG）界面模型可定量分析不同栅栏下目标微生物生长的可能性（或概率），获得不同环境因子下的生长／非生长信息，定量调节水产品内外环境，达到杀灭或抑制作用。微生物生长/非生长界面模型常采用Logistic回归法，食品中微生物生长/非生长界限模型多为致病菌模型，如单增李斯特菌、黄曲霉菌和蜡样芽孢杆菌等模型，用于控制微生物毒素的产生，保障食品安全。目前食品腐败菌模型的开发相对较少，如乳酸菌和结合酵母等，通过定量控制微生物的生长/非生长，延长产品的货架期。人工神经网络（Artificial neural Network，ANN）在食品加工工程中已广泛应用，其中PNN（Probabilistic Neural Network）神经网络算法适用于生长／非生长模型的建立，具有结构简单和训练速度快的特点，可利用线性学习算法实现非线性学习算法的功能，对微生物生长/非生长数据进行快速分类。采用Logistic回归法和PNN人工神经网络算法构建aw、pH及盐分交互作用下腐败希瓦氏菌生长/非生长界面模型未见研究报道。
本文选取鱼源腐败希瓦氏菌为研究对象，研究室温（25℃）条件下pH、aw及盐分（NaCl）对菌株腐败希瓦氏菌生长概率的交互影响，采用二阶线性Logistic回归方程拟合和PNN人工神经网络算法构建环境因子交互作用下生长/非生长界面模型。旨在评估鱼源腐败希瓦氏菌在pH、aw和盐分范围的生长动态，开发高效抑菌及定量评估方法，为保障海产品鲜度和品质安全提供支持。
1材料与方法
1.1试验材料
菌株D1从低温有氧贮藏大黄鱼货架期终点时分离，16SrRNA测序鉴定为腐败希瓦氏菌（序列号：KY786336），4℃保藏。
1.2试验试剂及仪器
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）；胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA）；1.0%盐酸；1.0%氢氧化钠；甘油和氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，上海）。
水分活度仪（AW LAB-Touch PMB35），大昌华嘉商业中国有限公司；pH计（pHS-3C），上海雷磁仪器厂；微生物生长测定仪（Bioscreen C），芬兰；洁净工作台（SW-CJ-1FB），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；低温培养箱（MIR-153），日本三洋公司。
1.3培养基制备
采用TSB作为培养基。25℃时，pH≤5.0或aw≤0.920或NaCl≥12%时，腐败希瓦氏菌不生长，海水平均盐度为3.5%，故交互试验因素和水平设计如表1所示，选取均分水分活度0.90，0.92，0.94，0.96作为训练集建立模型，为避免误差选择具有代表性的相同水分活度0.91为验证集，计120种工况，每种重复4次和1个空白平行。通过灭菌甘油调节水分活度，0.1 mol/L稀盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠调节pH。
表1腐败希瓦氏菌pH，aw和盐分交互试验设计
1.4菌悬液制备与接种
菌株活化：取腐败希瓦氏菌接种于无菌营养肉汤中，振荡30 s，25℃培养24 h，划线得到单菌落。
菌株接种：把调节过pH、aw和盐分的TSB经121℃灭菌后接入100孔微孔板，每孔180μL，取105CFU/mL的菌悬液20μL，最终接种液浓度为4.5 lgCFU/mL，接种入孔，每个条件4组平行，1个空白，25℃培养，每隔1 h测定其OD600nm值，测试周期为7 d。
1.5生长/非生长边界确定
当试验结束时，微孔中出现明显沉淀物或混浊，OD值高于空白3倍则判定为生长，判定为生长时，取微孔中培养液100μL涂布于TSA平板上，验证菌株是否仍为纯菌株。当OD值1～3倍之间时，涂布TSA平板验证，若平板出现典型菌落，
菌数与初始菌量差＞0.5 lgCFU/mL时，则判定为生长。每种情况下的生长概率由重复孔的生长情况计算获得，如4孔中2孔生长则该情况下生长概率为50%。
1.6建立生长/非生长模型
1.6.1 Logistic模型建立依据试验设计选取90例数据为训练集用来建立模型，Logistic模型如式1所示：
式中：p——生长／非生长概率；bi（0～9）——拟合参数；Na——盐分（V/V）。
1.6.2 PNN人工神经网络模型建立PNN人工神经网络模型是基于Bayes分类规则与Parzen窗的概率密度函数估计方法发展而来的一种并行算法。
将试验数据归一化后，依据试验设计选取90例数据，盐分、pH和aw作为三维向量进入输入层，在Matlab软件中进行训练，输出层神经元设定为1，结构概率≤0.5的记作1类非生长，＞0.5的记作2类生长。训练完成后剩余30例数据作为验证输入，验证训练模型的准确性。
1.7模型拟合优度及预测力评价
1.7.1拟合优度评价Logistic模型拟合优度采用似然比测试（-2lnL，the likehood test）、赤池信息准则（AIC=-2lnL+2k，Akaike's information criterion）、Hosmer-Lemeshow测试（HL）和R2-Nagelkerke进行评价。-2lnL、AIC常用于模型拟合优度评判，数值越小，证明拟合效果越好。Hosmer-Lemeshow用于评估模型任意数量的连续与分散的解释变量的拟合优度，数值越小，拟合效果越好，但无法将标准偏差纳入考虑，一个不理想的预测值亦可能导致该值的升高，故常结合R2-Nagelkerke值一起考虑，R2-Nagelkerke值主要反映了解释变量与响应变量间的关系，其值越接近1，拟合优度越好。
1.7.2预测力评价Logistic模型与PNN人工神经网络模型预测力采用C-matrix获得的一致率（Fraction correct，FC）和假阳性率（False alarm rate，FAR）进行比较，FC值越接近于100%说明预测效果越好，FC值为预测值与实际值的吻合度，FAR为假阳性错判率，可作为模型的预测准确度的参考。公式如下：
1.8模型验证
选取30例数据为验证集对模型进行验证，带入建立的Logistic模型与PNN人工神经网络模型中，采用FC%和FAR%模型验证的准确率和预测力进行评价。
1.9数据分析
使用SPSS18.0（美国IBM公司）对模型进行拟合模型，通过Origin9.0（美国OriginLab公司）绘制生长／非生长曲线，PNN人工神经网络建立采用MatlabR2016b进行建模。
室温条件下pH、aw及盐分对腐败希瓦氏菌生长概率的交互影响（一）
室温条件下pH、aw及盐分对腐败希瓦氏菌生长概率的交互影响（二）