2.4不同温度固态发酵高粱挥发性化合物差异分析
为找出不同发酵温度条件下发酵高粱的特征差异化合物，运用偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)对比了45℃和50℃条件下发酵高粱的挥发性化合物结构。结果显示，2种温度条件下挥发性化合物结构差异显著(P<0.01)(图8A)。经过200次置换验证，R2大于Q2且Q2的起点为负数，该参数证明PLS-DA模型是可靠的(图8B)。根据变异权重参数值(variable importance in projection,VIP)大于1筛选特征差异化合物，共筛选到27种，使用Z-score标准化每种挥发性化合物并绘制聚类热图(图8C)。45℃条件下癸酸乙酯、苯乙酸乙酯和棕榈酸乙酯等酯类物质含量更高，在45℃条件下含量随着发酵天数的增加而升高，而50℃则呈现相反趋势，推测45℃条件下利于酯类物质的合成。50℃条件下酮类和酸类物质含量更高，如5-甲基-2-己酮、4,6-二甲基-2庚酮、环己酮、异丁酸、己酸等，推测50℃条件下更利于象牙色克罗彭斯特德菌代谢产生酮类和酸类物质。
图8不同温度发酵高粱风味物质差异分析
A：PLS-DA模型.B：200次置换检验.C：特征差异物质聚类热图
2.5不同发酵天数固态发酵挥发性化合物差异分析
为找出不同发酵天数存在的特征差异化合物，分别对菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615、K.eburnea 6E22发酵高粱挥发性物质进行不同发酵天数的差异分析，PLS-DA显示挥发性化合物组成特点差异显著(P<0.05)(图9A)。经过200次置换验证，R2大于Q2且Q2的起点为负数，该参数证明PLS-DA模型是可靠的(图9B)。使用VIP值大于1筛选出26种特征差异物质，使用Z-score标准化每种挥发性化合物并绘制聚类热图(图9C)。1-烯-3-辛醇、2,3-二氢苯并呋喃和糠醛等在发酵第0天含量最高，糠醛被认为与酱香型白酒基酒焦糊味正相关。苯甲醛、α-松油醇和2-甲基吡嗪类物质在发酵第4天或第7天含量最高。α-松油醇是萜烯类化合物，具有松木香，是酱香型白酒中重要的香气成分，可以让酒体更加优雅细腻。萜烯类、吡嗪类化合物可能在发酵过程中作为前体物质被转化为其他物质，有研究通过全基因组数据挖掘发现放线菌糖莱斯氏菌(Laceyella sacchari)具有四甲基吡嗪生物合成的完整途径。苯乙醇、异戊酸、异丁酸、乙酸苯乙酯和棕榈酸甲酯等在发酵第15天时含量最高。乙酸苯乙酯和棕榈酸甲酯贡献了酒体中的花香、果香风味，属于高沸点物质，能够延长酒体后味。结果表明，象牙色克罗彭斯特德菌在堆积发酵的不同时间阶段能积累不同的风味化合物，可为生产中通过控制堆积发酵时间调控象牙色克罗彭斯特德菌的生长代谢提供理论参考。
图9不同发酵天数高粱风味物质差异分析
A：PLS-DA模型.B：200次置换检验.C：特征差异物质聚类热图
3、结论
高温堆积发酵是酱香型白酒生产中必不可少的关键工艺环节，直接影响酱香型白酒的质量和产量。本研究针对堆积发酵过程酒醅中的优势细菌属克罗彭斯特德菌属(Kroppenstedtia)进行分离筛选和代谢特征分析。经过形态特征及16S rRNA基因测序分析，共分离获得3株象牙色克罗彭斯特德菌(K.eburnea)。在TSB液体培养基45℃纯培养条件下，3株菌在18 h进入对数生长期，32 h进入平稳期，36 h时从菌液中检出的挥发性化合物主要是吡嗪类，其中菌株K.eburnea 1613的2,5-二甲基吡嗪含量最高，为5.26 mg/L，K.eburnea 1613的挥发性化合物含量普遍高于其余2株菌。
参考酱香型白酒堆积发酵条件，进行了恒温(45℃和50℃)固态发酵高粱实验，以研究它们在堆积酒醅中的生长和代谢特点。3株菌发酵高粱中检出的挥发性化合物总量随发酵时间呈明显的上升趋势，主要为醇类和酸类，占比之和为30.72%−84.01%，50℃发酵高粱中检出的醇类、酸类和吡嗪类物质含量均高于45℃的，而酯类物质低于45℃的。与对照相比，3株菌均促进了含量最高的醇类物质苯乙醇和吡嗪类物质的2,5-二甲基吡嗪产生，产量优势菌株分别是K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22；K.eburnea 1613和K.eburnea 1615在酸类物质积累上表现出明显优势，主要为异戊酸，其次是己酸。
对照组中主要的醛类物质含量高于3个实验组，固态发酵过程中醛类总量较稳定，酮类在15 d时最高，值得注意的是，高温有助于对照组中醛类和酮类物质的积累。菌株K.eburnea 1615在45℃发酵15 d时酮类总量最高，是对照的2.09倍。PLS-DA分析进一步显示不同发酵温度和时间下菌株固态发酵高粱中挥发性化合物结构差异显著。
本研究从菌株水平上探讨了象牙色克罗彭斯特德菌的风味物质代谢特征，并分析了温度对发酵高粱中挥发性化合物积累的影响，为认识高温堆积过程耐高温微生物在酱香型白酒风味形成中的作用提供理论基础。
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（一）
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（二）
酱香型白酒堆积酒醅中分离克罗彭斯特德菌生长和挥发性化合物代谢特征（三）
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