浓香型白酒窖香浓郁、绵甜醇厚、香味协调、尾净余长，是最受消费者喜爱的白酒之一。浓香型白酒以高粱、大米、玉米等淀粉质谷粮为原料，以中温大曲为糖化发酵剂，经长时间的泥窖密封发酵后蒸馏而得，其中泥窖密封发酵是形成浓香型白酒风味的过程，也是多种微生物繁衍更替的过程。窖泥是浓香型白酒制胜的法宝，也是生产必不可少的基础，其内含有大量的生香功能菌，这些功能菌代谢产生的有机酸类物质在酯化酶作用下合成的酯类物质是浓香型白酒窖香浓郁的根本。因此，加强窖泥中的酯化菌的研究对提升窖内酒醅质量具有重要意义。
目前为止，对窖泥中厌氧微生物的研究已超过几百种，其中生香功能细菌主要包括己酸菌、芽孢杆菌、乳酸菌、羧酸菌等。研究发现，梭状芽孢杆菌（Clostridium）对浓香型白酒的浓郁窖香具有重要贡献，其代谢产物主要为己酸和丁酸，同时伴随一些氢的产生。当甲烷菌与同产己酸的梭菌共生时能有效促进己酸乙酯生成，该研究对复合功能菌液和人工窖泥的改造培养提供了重要理论指导。此外，研究发现，窖池中的酯化菌以芽孢菌为主，对泸州老窖不同窖龄的窖泥中产香的兼性厌氧菌进行分类计数，发现芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus）为窖池优势菌属，其中大多菌株能产生丁酸和己酸等有机酸；研究发现白酒在发酵中、后期，酒醅中的芽孢杆菌大量增殖，成为优势菌群，是重要的酯化生香菌。
针对窖泥酯化生香菌微生物多为厌氧芽孢杆菌，本试验以优质老窖泥为研究对象，厌氧条件下富集酯化菌，并对富集条件进行优化，通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatographicmass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术对富集液中的酯类物质及其含量进行检测，确定富集效果；再通过传统培养分离方法从中筛选产己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，采用形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行菌种鉴定，并研究其生长特性，以期为提高浓香型白酒酒质奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1样品
窖泥：无菌操作采集泸州某名优酒厂老窖池底泥，迅速置于冰盒运回实验室，4℃冰箱保存。
1.1.2培养基
富集培养基：乙酸钠3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉粉10.0g/L、L-半胱氨酸盐0.25g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖5.0 g/L、可溶性淀粉1.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、超纯水1 000 mL、pH值为6.0±0.1，121℃高压蒸汽灭菌15 min。
筛选培养基：葡萄糖10 g/L、氯化钠0.01 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.25 g/L、硫酸锰0.01 g/L、硫酸镁0.2 g/L、甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）0.5 g/L、蛋白胨0.1 g/L、酵母膏1.0 g/L、琼脂20 g/L、三丁酸甘油酯4 mL（在倒平板前加入）、超纯水1 000 mL，自然pH值，121℃高压蒸汽灭菌15 min。液体培养基中不添加琼脂。
1.1.3试剂
乙酸钠、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸镁、琼脂、三丁酸甘油酯（均为分析纯）、乙酸正丁酯（色谱纯）：成都艾科达化学试剂有限公司；EMS、L-半胱氨酸盐酸盐（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2仪器与设备
HVE压力蒸汽灭菌锅；BF-2000M氮气吹浓缩仪；LRH-250恒温培养箱、HW326恒温水浴锅；M367983聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪；YIQI-125凝胶成像系统；7890A-5975B气相色谱-质谱仪；α1860紫外分光光度计；AW200SG厌氧工作站。
1.3方法
1.3.1窖泥中酯化菌的富集方法
称取5 g窖泥装入含有45 mL无菌水的螺口瓶中，90℃恒温水浴处理30 min，冷却后于厌氧工作站按5%（V/V）的接种量接入富集培养基中，34℃条件下培养。
1.3.2窖泥中酯化菌富集条件的确定
富集时间：样品同1.3.1处理后，分别于34℃培养箱中培养0 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d，每组试验3组平行。
富集次数：样品同1.3.1处理后，在最佳富集时间下对富集液连续富集4次。
通过HS-SPME-GC-MS检测富集液中酯类物质含量及种类确定最佳富集时间和次数。
1.3.3窖泥中酯化菌的分离纯化
将富集液于90℃恒温水浴处理30 min后，吸取1 mL富集液，按10倍梯度稀释至10-5，选取稀释梯度为10-2～10-5的菌液0.1 mL分别涂布至筛选培养基（已在厌氧工作站中静置24 h），34℃条件下培养2～10 d（期间观测菌落变化），挑选有透明圈的菌落进行分离、纯化。将纯化后的单菌株接种于富集培养基中（加入2%（V/V）乙醇），34℃培养15 d，通过GC-MS检测发酵产物中有无己酸乙酯或丁酸乙酯。
1.3.4窖泥中酯化菌培养条件研究
种子液制备：于厌氧工作站中将目的菌株分别接种于液体筛选培养基中，34℃条件下严格厌氧培养48 h。
生长曲线：按5%（V/V）的接种量将不同菌株的种子液分别接种于液体筛选培养基，34℃条件下严格厌氧培养，每8 h取出8 mL培养液，采用紫外分光光度计在波长660 nm处测定吸光度值（OD660nm值）。
生长温度：按5%（V/V）的接种量将不同菌株的种子液分别接种于液体筛选培养基，分别置于20℃、30℃、34℃、37℃、41℃、45℃和60℃条件下严格厌氧培养48 h。
生长pH值：按5%（V/V）的接种量将不同菌株的种子液分别接种于不同pH值（2～10）的液体筛选培养基，34℃条件下严格厌氧培养48 h。
乙醇耐受性：按5%（V/V）的接种量将不同菌株的种子液分别接种于乙醇体积分数不同（2%～23%）的液体筛选培养基，34℃条件下严格厌氧培养48 h。
以上试验分别取8 mL发酵液，测定OD660nm值，且均以未接种的培养基为空白对照。
1.3.5窖泥中酯化菌的鉴定
形态观察及生理生化试验：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对筛选的目的菌株选择性地进行形态观察和生理生化鉴定。
分子生物学鉴定：提取目的菌株的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其为模板，采用细菌通用引物27F、1492r对目的菌株的16S rDNA基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物委托上海美吉公司进行测序。将测序结果提交至美国国家生物信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank数据库中进行Blast同源性比对搜索，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0软件的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树。
1.3.6酯类物质的检测
取5 mL富集液或发酵液于顶空瓶中，再加入2 g NaCl和0.25 mL乙酸正丁酯（0.2 mg/mL）作为内标，混匀，置于55℃固相微萃取仪中平衡15 min后，插入萃取针头萃取30 min，进行GC-MS检测。质谱图通过与美国Agilent公司提供的美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）05a.L标准谱库进行比对，利用匹配度均＞800的特征离子进行定性分析；采用内标法进行半定量。
1.3.7数据分析
结果以“平均值±标准偏差”表示。利用SPSS19.0软件进行方差分析，采用Origin 8.0软件作图。
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