2结果与分析
2.1照光对稻曲病菌菌丝生长的影响
对在PSA平板上培养7、15、20 d后的ZJ09菌株菌落直径进行测量，结果表明：黑暗组和照光组的菌落直径差异显著（P＜0.01），培养7、15、20 d后照光组的菌落直径都显著小于黑暗组的菌落直径（图1）。用显微镜观察2组菌落，比较其菌落内部（非边缘区域）可以看到，2组菌落的厚度、菌丝密度无明显差异；从菌落边缘可以看到，2组菌落的菌丝在粗细、分支情况方面都未见明显差异（图2）。由此可得，照光组和黑暗组稻曲病菌的菌落直径有显著差异，反映出二者菌丝生长速率不同，表明照光可以明显抑制稻曲病菌菌丝的生长。
图1照光对PSA平板上ZJ09菌株菌落生长的影响
图2黑暗组与照光组ZJ09菌株菌落状态的比较
2.2文库及转录组输出数据结果
为了从转录组水平探究照光抑制ZJ09菌株菌丝生长的机制，本试验构建了4个cDNA文库（CK_D1、CK_D2、Uv_L1和Uv_L2），其中，文库CK_D1与CK_D2为黑暗组的2个重复，文库Uv_L1与Uv_L2为照光组的2个重复。文库质检合格后进行高通量测序。测序数据经整理、过滤后，共获得6G数据量的高质量序列，达到转录组测序对数据深度的要求。最终的序列数量、碱基数量以及识别准确率见表2。从中可以看出，高质量识别序列占比及高质量识别序列碱基占比均大于97%。
转录组测序所得序列与稻曲病菌参考基因组的比对结果见表3。从中可以看出：在4个文库测序所得序列中，能与参考基因组序列匹配的序列占比均超过85%，且仅比对到一个位置上的序列占比均超过97%。
上述结果表明，本次转录组测序结果质量优良，可用于生物信息学统计和分析。
2.3差异表达基因的鉴定结果
对黑暗组与照光组ZJ09菌株菌丝的转录组测序数据进行差异分析，共得到695个DEGs，其中359个被照光上调表达，336个被照光下调表达。
2.4差异表达基因的GO富集分析结果
GO的基本单位是类别（term），可分为生物过程（biological process）、细胞成分（cellular component）和分子功能（molecular function）3个大类别，每个大类别中包含许多亚功能类别。如图3所示，在本试验得到的695个DEGs中，491个DEGs获得GO富集，3个GO大类别中都有DEGs富集。在生物过程大类别中，富集较多DEGs的GO亚功能类别为代谢过程、含氮化合物代谢过程、生物合成过程、有机氮化合物代谢过程、细胞生物合成过程、有机物生物合成过程、蛋白质代谢过程、细胞蛋白代谢过程。在细胞成分大类别中，富集较多DEGs的GO亚功能类别为无膜细胞器、胞内无膜细胞器、胞内核糖核蛋白复合物、核糖核蛋白复合物、核糖体。在分子功能大类别中，富集较多DEGs的GO亚功能类别为氧化还原酶活性、核糖体结构成分、结构分子活性。初步可以看出，照光主要在这些GO类别所描述的生物过程、细胞成分和分子功能方面对稻曲病菌菌丝产生了影响，从而抑制了稻曲病菌的生长速率。
图3稻曲病菌菌丝差异表达基因的GO富集分析结果
2.5差异表达基因的KEGG通路注释结果
本试验所得的DEGs被注释到152个KEGG通路中，富集DEGs最显著的20条通路见表4。在这20条通路中，核糖体通路涉及的DEGs有59个，明显多于其他的KEGG通路。但在除核糖体通路外的其余19条通路中，发现有8条通路与氨基酸代谢有关，涉及53个DEGs。上述结果说明，照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能与核糖体结构和功能，以及氨基酸代谢受到影响有较大关系。
2.6照光对乙酰辅酶A合成酶编码基因表达水平的影响
对鉴定到的695个DEGs，除利用软件进行GO富集和KEGG通路分析外，还逐一考察了每个DEG的功能。结果发现：DEGs中包含1个乙酰辅酶A合成酶（acetyl-coenzyme A synthetase,ACS）编码基因，照光组样品中ACS编码基因的表达水平只有黑暗组样品的18.2%，说明照光对稻曲病菌菌丝中ACS编码基因的表达存在显著的抑制效果。ACS可催化乙酰辅酶A的合成，是微生物体内乙酰辅酶A的重要来源之一。乙酰辅酶A是生物体内物质和能量代谢的枢纽性物质。抑制ACS编码基因的表达有可能减少生物体内乙酰辅酶A的含量，从而影响乙酰辅酶A参与的众多代谢过程。因此，推测照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能与其抑制ACS编码基因的表达有很大关系。
表3过滤后的测序数据与参考基因组序列比对结果
2.7 RT-qPCR对转录组测序验证的结果
如图4所示，受测的6个基因（分别对应表1中编号2～7所代表的基因）中，有3个受照光上调表达，另外3个受照光下调表达；这6个基因表达的变化趋势与用转录组测序得到的结论一致，说明本次转录组测序结果的可信度很高。
图4转录组数据的RT-qPCR验证
3、讨论
关于照光对稻曲病菌菌丝生长的影响，有研究报道了2种不同的结论。FU等和季宏平分别报道了照光对稻曲病菌菌丝生长的抑制作用；吕锐玲等和陆凡等的研究则得出，照光对稻曲病菌菌丝生长无影响。本研究发现，照光组稻曲病菌菌丝的生长速率明显低于黑暗组的生长速率，显示照光可以抑制菌丝的生长，表明照光条件是该菌菌丝生长的调控因子之一。
为了进一步探究照光抑制稻曲病菌菌丝生长的机制，本研究还分别采集照光和黑暗条件下培养的菌丝进行转录组测序，通过比较2组菌丝的转录组鉴定了DEGs，并对DEGs进行了GO富集和KEGG通路分析。这是关于照光影响稻曲病菌菌丝生长分子机制的首次报道。
乙酰辅酶A是各类生物体中极其重要的能量及物质代谢中间产物，参与生物体内许多重要的代谢过程，比如三羧酸循环、脂肪酸生物合成，等等。在微生物体内，ACS可催化乙酸直接转化为乙酰辅酶A。野生型的希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum）能在以乙酸、乙醇或乙醛作为碳源的培养基上存活，但ACS编码基因ChAcs1被敲除的希金斯炭疽菌不能在这些培养基上存活。当微生物在含葡萄糖的培养基上生长时，理论上葡萄糖可经过糖酵解分解为丙酮酸，而丙酮酸可以借由丙酮酸脱氢酶复合体（包含丙酮酸脱羧酶、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶）催化转变为乙酰辅酶A，因此可以不依赖ACS。然而，即使有葡萄糖作为碳源，敲除ChAcs1仍可显著改变希金斯炭疽菌中一系列碳代谢相关基因的表达，并使菌丝中的脂含量降至野生型菌株的60%。VAN DEN BERG等尝试将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的2个ACS编码基因之一ACS2失活，发现酵母菌突变菌株在含葡萄糖的培养基上的生长受到抑制；进一步将2个ACS编码基因ACS1和ACS2同时失活，发现酵母菌突变菌株在含葡萄糖的培养基上也不能存活，说明即使有葡萄糖作为营养物质，酵母菌的存活也离不开ACS。上述研究表明，不管微生物利用何种碳源，ACS都具有重要作用。本研究的结果显示：照光可显著抑制稻曲病菌菌丝中ACS编码基因的表达，削弱菌丝的乙酰辅酶A合成能力可能是照光抑制稻曲病菌菌丝生长的机制之一。
HOG1（high osmolarity glycerol 1）是最先从酿酒酵母中鉴定出的一种蛋白激酶，现已被证实广泛存在于各种真核生物中。HOG1介导的信号途径参与调控真核细胞对渗透胁迫的响应。ZHENG等敲除稻曲病菌的HOG1编码基因UvHOG1后，发现突变体菌丝的生长明显弱于野生型菌丝，显示稻曲病菌的HOG1可调控菌丝的生长。本试验从黑暗组与照光组稻曲病菌菌丝中均检测到UvHOG1基因的表达，但2组菌丝中该基因的表达量无明显差异，因此该基因不属于DEG，说明照光对菌丝中UvHOG1基因的表达没有影响。因此，推测照光抑制稻曲病菌菌丝的生长与蛋白激酶HOG1无关。
表4稻曲病菌菌丝差异表达基因的KEGG通路分析结果
Bax抑制子1（Bax inhibitor-1,BI-1）是一种在动物、植物和真菌中都存在的高度保守的细胞死亡调控因子。此蛋白能抑制细胞凋亡相关蛋白Bax诱发的细胞死亡，具有抗细胞凋亡功能。XIE等敲除稻曲病菌的BI-1同源基因UvBI-1后，菌丝的生长速率有所提高。与UvHOG1基因类似，在本稻曲病菌菌丝转录组研究的结果中，UvBI-1基因不属于DEG，说明照光对菌丝中UvBI-1基因的表达没有影响，因此推测照光抑制稻曲病菌菌丝的生长与BI-1无关。
本转录组测序的结果显示，一些其他植物病原真菌致病力相关因子的编码基因在稻曲病菌中的同源基因被照光上调表达，比如DEGs包含1个CFEM（conserved fungal-specific extra-cellular membranespanning）蛋白的编码基因（UVI_02042610），其在照光组菌丝中的表达水平是在黑暗组菌丝中的23.9倍，表明照光可能显著上调菌丝中CFEM蛋白的表达。CFEM蛋白为真菌所特有，已被证实是植物病原真菌效应子。比如禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）与稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的CFEM蛋白已被证实在病原菌侵染寄主植物的过程中发挥作用。除CFEM蛋白编码基因外，本研究中鉴定到的DEGs还包括过氧化物酶体铜胺氧化酶编码基因、过氧化物酶体膜蛋白编码基因，二者的表达均被照光上调。已有研究表明，植物病原真菌过氧化物酶体与脂肪酸β-氧化及乙醛酸循环等代谢过程密切相关，影响许多病原真菌的致病性。根据上述结果，照光可能对稻曲病菌的致病力有增强作用，后续可通过接种试验验证。
对粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和裂褶菌（SchizophyllumcommuneFr.）等一些真菌的研究发现，照光对真菌的影响有可能通过光受体介导。目前已鉴定到一些光受体，如感应蓝光的WC-1（white collar-1）和WC-2（white collar-2），感应红光及远红光的光敏色素和视紫红质等。WC-1具有LOV感光结构域，通过该结构域可以直接感受光信号的刺激。WC-1可与WC-2形成复合物，调控下游基因的表达，从而调控真菌的生长与产孢。不同的真菌中，WC-1可能具有不同的靶标基因。蛹虫草菌（Cordyceps militaris）不管是否受到照光，其WC-1光受体蛋白都有一定量的表达，但若受到照光，表达量会明显增多，然后逐渐减少。迄今尚未见到任何关于稻曲病菌光受体的研究报道。本试验从黑暗组与照光组稻曲病菌菌丝中均检测到1个与粗糙脉孢菌WC-1编码基因具有较高同源度的基因（UVI_02002710）的表达，但在2组菌丝中该基因的表达量无明显差异，因此不属于DEG，表明该基因与照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能无关。是否有其他光受体参与到照光对稻曲病菌菌丝的生长调控中，仍有待研究。
4、结论
在培养稻曲病菌的过程中对菌落的观测结果显示，照光可抑制菌丝的生长，光照条件是稻曲病菌菌丝的一种生长调控因子。采集黑暗组与照光组菌丝，分别进行转录组测序，比较2组菌丝的转录组后得到695个DEGs，其中359个被照光上调表达，336个被照光下调表达。对DEGs进行GO富集分析的结果显示：生物过程、细胞成分和分子功能这3大类别都有DEGs富集，说明照光抑制稻曲病菌菌丝的生长涉及复杂的机制。对DEGs进行KEGG通路注释的结果表明，照光抑制稻曲病菌菌丝的生长可能主要与核糖体结构和功能，以及氨基酸代谢受到影响有较大关系。DEGs包含1个ACS编码基因且照光显著抑制其表达，推测削弱菌丝的乙酰辅酶A合成能力可能是照光抑制稻曲病菌菌丝生长的机制之一。DEGs未包含UvHOG1和UvBI-1基因，因此，照光抑制稻曲病菌菌丝的生长与蛋白激酶HOG1及BI-1无关。