1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1细胞、病毒及营养素
猪流行性腹泻病毒（PEDV，YN株），由华中农业大学微生物重点实验室馈赠；3D4/21细胞，由华中农业大学微生物重点实验室馈赠；ML，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2主要试剂
主要试剂见表1。
1.1.3主要仪器
主要仪器见表2。
1.2方法
1.2.1试剂的配制
细胞完全培养液：在RPIM 1640培养液中添加1%青链霉素混合液(penicillin-streptomycin solution，PSF)、10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS）、1%非必需氨基酸（终浓度1 mol/L）和1%丙酮酸钠（终浓度1 mmol/L）。
表2主要仪器
DMEM定制培养液：用DMEM粉末配制，添加血清和PSF，用1 mol/L盐酸调pH为7.2~7.4。主要成分见表3。
1.2.2 ML对3D4/21细胞活性的影响
①细胞处理。将细胞浓度调为1.2×104个/mL（此时用含10%FBS的RPMI 1640培养液），调好的细胞悬液用排枪加到96孔板，每孔0.1 mL，置于5%CO2、37℃培养箱中。等到96孔板的细胞长至20%左右时，吸出原有的培养基，用PBS洗2遍细胞后，换成含不同浓度的ML（0、0.5、1、10、20、50μmol/L）的培养液（不同浓度的ML培养液用2%FBS的RPMI 1640培养液配制），每个浓度水平10个重复，每个重复一个孔。放在培养箱中培养3 d，每天换液，等某组处理的细胞长满单层后，吸出培养基，PBS洗2遍后，再每孔加0.1 mL配制好的含10%CCK-8的定制培养基，并设置只含10%CCK-8 0.1 mL的无细胞组作为阴性对照组。加入试剂后再培养2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
②计算细胞活性。
细胞活性（%）=（试验组OD值-阴性对照组OD值）/（空白对照组OD值-阴性对照组OD值）×100试验数据用SPSS 26.0统计软件中的one-wayANOVA和Duncan’s多重比较，以P<0.05为差异显著性标准。
1.2.3 PEDV在3D4/21细胞中的生长曲线
①细胞培养液。基础RPMI 1640培养液再补加1%PSF、1%非必需氨基酸（终浓度1 mmol/L）和1%丙酮酸钠（终浓度1 mmol/L）。
②细胞处理。将细胞培养液的浓度调整为2.2×105个/mL，铺6板24孔板，每孔2 mL。设置空白组和PEDV组，空白组加1 mL的培养基，PEDV组细胞加1 mL病毒稀释液（即病毒原液按20倍稀释，原液104.5 TCID50），每组设4个重复；病毒吸附1 h后弃去液体，再添加2 mL培养液，从放回培养箱起开始计时，在0、6、12、24、36、48 h每个时间点拿出一板，放在-80℃冰箱反复冻融3次（使得细胞中的病毒全部裂解到上清液中），取上清液待测。
③病毒基因相对表达量的测定方法。用TRIzol法提取细胞上清液的总RNA，在保证样品质量合格的情况下，先反转成cDNA，然后用荧光定量PCR仪检测3D4/21细胞中病毒基因PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N的相对表达水平。以HRPT1作为内参基因，数据分析及表达量的计算参考Fu等。引物序列见表4。
1.2.4 ML对PEDV感染3D4/21细胞基因表达的影响
①细胞处理。铺4板24孔板，每孔加入500μL细胞培养液（密度为2.2×105个/mL）。根据ML的添加时间点不同，分为两种处理方式（全时添加ML和PEDV感染细胞后添加ML）。每种处理方式有3组（control组、PEDV组、PEDV+ML组），每组4个重复。
细胞长满单层弃去完全培养液，用PBS洗两遍。
表3 DMEM定制培养液配方成分
处理方式1：全时添加ML。
control组和PEDV组加入500μL的RPMI 1640培养液，PEDV+ML组加入500μL含ML（浓度为10μmol/L）的RPMI 1640培养液。放入培养箱培养3 h后，PEDV组和PEDV+ML组加入PEDV病毒稀释液，待病毒吸附1 h后，弃去细胞上清液。control组和PEDV组每孔加入500μL RPMI 1640培养液，PEDV+ML组每孔加入500μL含ML（浓度为10μmol/L）的RPMI 1640培养液，继续培养12 h或24 h。
表4基因的引物序列
处理方式2：PEDV感染细胞后添加ML。PEDV组和PEDV+ML组加入PEDV病毒稀释液。病毒吸附1 h后，弃去细胞上清液。control组和PEDV组每孔加入500μL RPMI 1640培养液，PEDV+ML组每孔加入500μL含ML（浓度为10μmol/L）的RPMI1640培养液，继续培养12 h或24 h。
②基因相对表达量的测定方法。处理结束后收集细胞，提取RNA，检测不同处理方式3D4/21细胞PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N、IL-6、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1、IFITM3、MMP13、KCNJ13等基因的相对表达量，引物序列见表4，以HRPT1作为内参基因，数据分析及表达量的计算参考Fu等的方法。
试验数据
用SPSS 26.0统计软件中的one-wayANOVA和Duncan’s多重比较，以P<0.05为差异显著性标准。
十二酸单甘油酯对PEDV感染3D4/21巨噬细胞活性、基因表达的影响（一）
十二酸单甘油酯对PEDV感染3D4/21巨噬细胞活性、基因表达的影响（二）
十二酸单甘油酯对PEDV感染3D4/21巨噬细胞活性、基因表达的影响（三）
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