2、实验结果与分析
2.1噬菌体形态特征
以溶藻弧菌V039为宿主，采用点斑法筛选得到噬菌体φV039C(见图1a)，经纯化后得到的噬菌斑清晰，直径在1 mm左右，呈现出透明、无晕圈的形态(见图1b)。通过电镜观察(见图1c)，该噬菌体的头部结构是正廿面体结构，头部直径(58.9±2.9)nm，尾长(105.2±5.7)nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)第九次报告的病毒分类系统，噬菌体φV039C在分类上可能属于有尾噬菌体目(Caudovirales)长尾噬菌体科(Siphoviridae)。
2.2噬菌体基因组酶切结果
酶切产物电泳结果(见图2)显示：噬菌体φV039C的基因组能被DNase I降解，但不能被RNase A降解，说明其基因组类型是DNA；电泳结果也表明其基因组上有EcoR V、HindⅢ和EcoR I的酶切位点，但没有BamH I酶切位点。因此，噬菌体φV039C基因组类型属于dsDNA。
2.3噬菌体的最佳感染复数
按照不同的感染复数(MOI)混合噬菌体和宿主菌液培养8 h之后，用双层板测定各个MOI的效价。实验结果(见表1)表明，当噬菌体与宿主比值为0.1时，噬菌体效价最高，能够达到3.34×1010pfu/mL，因此噬菌体φV039C的最佳感染复数为0.1。
表1不同感染复数下噬菌体φV039C的效价
2.4噬菌体的一步生长曲线
由噬菌体φV039C的一步生长曲线(见图3)可得出，噬菌体与宿主菌混合培养20 min，效价无明显变化，因此噬菌体φV039C的潜伏期为20 min；20—30 min噬菌体效价呈现上升趋势；30 min后噬菌体效价稳定。由此得，噬菌体爆发期为培养后10 min。噬菌体裂解量=爆发期末期噬菌体密度/初始受感染宿主菌密度=(5.06×107)/(3.10×105)=163 pfu/cell。
2.5噬菌体全基因组分析
第三代单分子测序平台测序结果表明，噬菌体φV039C的基因组(GenBank登录号MN956515)为环形双链DNA，全长为43 405 bp，G+C含量为42.95%(见图4)。共注释得到77个开放阅读框(open reading frame，ORF)。其中，已知功能阅读框有17个，假想蛋白有20个，未注释出的阅读框有40个。核酸序列长度在213～2436 bp，对应的蛋白质序列长度在71～812。所有ORF共含有40 870 bp的碱基，基因组的基因密度为94.20%。
用NCBI网站的blastn(megablast)程序进行噬菌体φV039C的基因序列比对，在得到的同源序列中，噬菌体φV039C与溶藻弧菌噬菌体NF(MN812722)、副溶血弧菌噬菌体Seahorse(MN512538)的比对覆盖率最高，同为11%，一致性分别为92.2%和93.3%，即从基因组来看，噬菌体φV039C与这二者最为接近。二者在分类上均属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。噬菌体φV039C与溶藻弧菌噬菌体PVA1(KJ395778)的覆盖率次之，为2%，其余检索结果覆盖率仅为1%。使用Mauve软件对3个基因组进行共线性比对分析(见图5)，发现三者相互之间存在5个同源片段，但位置、顺序不同，相似性也不高。
由全基因组的比对结果可见，噬菌体φV039C与现有NCBI登录的其他噬菌体基因组相似区的比例很低，是一株新型的溶藻弧菌噬菌体。
2.6噬菌体φV039C功能性ORF的分析
对噬菌体φV039C的基因组进行ORF注释，共注释出74个ORF(见表2)。
表2噬菌体φV039C的开放阅读框注释表
表2中的ORF1(重组酶)、ORF3(单链DNA结合蛋白)、ORF49(连接内脱氧核糖核酸酶)、ORF57(DNA结合蛋白)、ORF58(转录调控因子)、ORF65(DNA螺旋酶)、ORF66(DNA结合蛋白)与噬菌体DNA复制有关；ORF6(N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶)为裂解酶，属于噬菌体的裂解系统；ORF25(孔道蛋白)、ORF28(次要衣壳蛋白)、ORF29(主要衣壳蛋白)、ORF39(尾部装配子)等属于噬菌体结构蛋白。
2.7噬菌体φV039C比较基因组学和系统发育树的构建
为探究噬菌体φV039C与其他噬菌体的进化关系，选择N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶(ORF6)和大亚基终止酶(ORF19)两种蛋白进行系统进化树的构建。从基于N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶构建的系统进化树可以看出，φV039C与副溶血弧菌噬菌体Seahorse、溶藻弧菌噬菌体NF有着较近的亲缘关系(见图6)，这与全基因组的blast结果相近。而从基于大亚基终止酶构建的系统进化树可以看出，噬菌体φV039C与灿烂弧菌噬菌体1.144.0._10N.286.45.B3在同一分支上(见图7)，后者在分类上也同样属于长尾噬菌体科。综上所述，噬菌体φV039C在分类上应归属有尾噬菌体目长尾噬菌体科。
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