摘要乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种危害严重的人畜共患病毒,囊膜蛋白(envelope protein,E)对JEV的神经毒力起关键作用。前期研究发现,重组乙型脑炎病毒(recombinant Japanese encephalitis virus,rJEV)囊膜蛋白I176R位点突变可致弱其神经毒力。为鉴定rJEV-EI176R位点突变后其生物学特性的变化,本研究克隆分析了E176位点突变重组病毒rJEV-EI176R的E基因序列和E蛋白的生物信息学特征;利用qPCR、蚀斑试验和间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)等技术测定rJEV-EI176R的生长曲线、对多种细胞的吸附差异和rJEV-EI176R诱导小鼠小胶质细胞系(mouse microglia cell line,BV-2)细胞炎性水平差异。结果显示,rJEV-EI176R的E蛋白带正电荷的残基增加1个,等电点升高0.37,不稳定指数升高0.39;E蛋白的α螺旋、β折叠、延伸链以及无规则卷曲的数量及占比均发生了改变,同时E176位点氨基酸与附近氨基酸有了不同的连接;rJEV-EI176R在BV-2细胞上的生长曲线没有显著变化且能够感染不同来源的神经细胞和肾细胞;rJEV-EI176R的吸附能力显著提高(P<0.05)但蚀斑大小变化不显著;rJEV-EI176R接种BV-2细胞后,在12和24 h均引起肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干扰素γ诱导蛋白-10(interferon-gamma-induced protein-10,IP-10)的水平显著低于亲本株(P<0.05)。本研究丰富了JEV毒株E蛋白的生物学特性研究,为后期深入研究JEV减毒机制和疫苗研发提供基础资料。
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种危害严重的人畜共患病原(Desingu et al.,2017;Lu et al.,2017)，可引起人类病毒性脑炎，严重危害人类健康，现已成为国际公共卫生问题；同时，JEV可造成公猪(Sus scrofa)睾丸炎、怀孕母猪流产或弱胎和仔猪脑炎，威胁我国生猪养殖业的发展(Jamgaonkar et al.,2003;曾小凤,2013)。
JEV E蛋白在病毒结合和入侵宿主细胞中起着关键作用(Nain et al.,2016;Mukhopadhyay etal.,2005)，同时还含有血凝素与中和抗原决定簇，参与病毒的复制、细胞嗜性、致病性、适应性等，且与诱导宿主的免疫性应答关系密切(Mackenzieet al.,2004)。E蛋白上含有多种抗原表位，因此是病毒感染后诱发保护性免疫反应最关键的蛋白，能够诱导宿主细胞产生中和抗体(Hurrel‐brink,McMinn,2003;Mukhopadhyay et al.,2005)。
目前已有大量证据表明，E蛋白的氨基酸残基突变可导致JEV的神经毒力致弱，如减毒菌株SA14-14-2、RP-2ms、CH2195LA和CJN-S1(Ni etal.,1994;Yu,2010;Chiou,Chen,2007;Ni,Barrett,1998;Wu,Lee,2001;Wu et al.,2003)。SA14-14-2弱毒株是其亲本毒株SA14在细胞上传代获得，两毒株E基因上存在8个氨基酸位点突变(E107,E138,E176,E177,E264,E279,E315和E439)，Yang等(2017)研究明确了E107和E138位置的氨基酸是SA14-14-2神经毒力致弱的关键决定因素。研究发现，E-244处的甘氨酸Gly-谷氨酸Glu突变足以赋予小鼠(Mus musculus)致命的神经毒力，包括在中枢神经系统中病毒的迅速传播和组织炎症(Yun et al.,2014)。JEV的E138、E47位点的突变能够使JEV毒株的毒力发生改变，并且酸性突变增强神经毒力，碱性突变减弱神经毒力(Zheng et al.,2018)。在这些致弱的突变株中，同样包含E蛋白176残基，本课题组前期通过反向遗传平台成功包装、拯救了重组亲本株病毒rSA14和重组突变株病毒rJEV-EI176R，并已证明E蛋白I176R单点突变会致弱其神经毒力(Zhouet al.,2018b;Zhou et al.,2018a)。因此，探究E蛋白I176R单点突变后的生物学特性对于阐释病毒致弱机制和疫苗开发具有重要意义。本研究拟通过基因克隆和生物信息学软件对E基因的序列进行比对和生物信息学分析，以多种细胞为研究对象，通过比较突变毒株rJEV-EI176R的生长特性、吸附差异和诱导细胞因子的水平差异等研究，以期阐释E蛋白I176R单点突变后的生物学特性，为后期深入研究JEV减毒机制和疫苗研发提供基础资料。
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——摘要、前言
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——材料与方法
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——结果与分析
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——讨论、结论