目的：探讨小鼠β-防御素-2（beta defensin 2，BD2）对SiHa细胞生长的抑制作用及其机制。方法将pcDNA3．1（＋）/mBD 2、pcDNA3．1（＋）/rmBD 2质粒转染SiHa获得的稳定转染细胞SiHa/M、SiHa/R裂解，用细胞裂解上清进行Western blot检测mBD2蛋白表达；同时采用细胞活力分析对转染细胞的细胞活力进行测定，采用AnnexinⅤ、PI流式细胞分析法和TUNEL法检测细胞凋亡情况，并计算细胞凋亡指数。结果SiHa/M、SiHa/R组在4～6 Ku区域出现目标条带；SiHa/M、SiHa/R组细胞在贴壁后2～3 d细胞活性明显低于SiHa细胞（P＝0．018），但随着时间推移，细胞活性开始下降，3组细胞的细胞活力差异无统计学意义（P＝0．374）；SiHa/M、SiHa/R及SiHa组AnnexinⅤ＋/PI＋双阳性细胞的百分率分别为2．4％、2．3％、2．3％；AnnexinⅤ＋/PI-细胞分别为0．9％、1．2％、1．5％，3组差异无统计学意义（P＝0．743）；SiHa/M、SiHa/R组凋亡细胞发生率较高，分别达到40．7％、30．2％，而SiHa组细胞凋亡率只有7．3％，SiHa/M、SiHa/R组细胞凋亡率明显高于SiHa组，差异有统计学意义（P＝0．004）；SiHa/M组凋亡发生率高于SiHa/R组，差异有统计学意义（P＝0．003）。结论mBD 2能够抑制SiHa细胞的生长和诱导细胞凋亡。
抗菌肽是生物体抵御外界病原生物侵袭而产生的一种小分子多肽，具有广谱的抗菌活性，并有抗真菌、病毒等生物学活性，而对正常细胞无伤害，是机体在长期进化过程中保留下来的一种古老的宿主防御机制。哺乳动物体内的抗菌肽主要是防御素(defensins)，作为生物体内天然防御系统的重要组成部分，连接天然免疫和获得性免疫反应，对机体抵抗外界生物感染起着关键的作用。此外，许多科学研究表明防御素也具有抗肿瘤效应，但其机制尚不完全清楚。现阶段已发现的500多种抗菌肽中，有18种抗菌肽的抗肿瘤活性已得到实验证实。宫颈癌是倍受世界关注的女性高发肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，在全球位列女性恶性肿瘤的第二位，宫颈癌的防治成为保护妇女儿童健康的全球共同关注问题。随着生物技术的发展和肿瘤发生分子机制的深入研究，生物治疗已成为肿瘤综合治疗的第4种模式，并具有广泛的应用前景。
本课题前期研究工作中，采用pcDNA3.1(+)/mBD2和具有明确穿膜功能的小鼠IgGΚ链的信号肽基因替代mBD2信号肽基因，形成IgGΚ链、成熟肽2个部分的重组防御素分子质粒pcDNA3.1(+)/rmBD2转染SiHa细胞，制备了宫颈癌细胞瘤苗SiHa/M、SiHa/R。本研究对细胞的特性进行了体外研究，为进一步观察其体内抗宫颈癌效果奠定基础，同时为将防御素应用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株及质粒稳定转染pcDNA3.1(+)/mBD2质粒、pcDNA3.1(+)/rmBD2质粒宫颈癌细胞株SiHa/M、SiHa/R本室保存，宫颈癌SiHa细胞由四川大学华西医学中心免疫学教研室魏大鹏老师惠赠，用RPMI1640细胞培养基、10%胎牛血清在37℃、50 mL/L CO2条件下进行培养。
1.1.2试剂
RPMI1640、胎牛血清(GIBCO公司)，PVDF膜(invitrogen公司)，5%脱脂奶粉(invitrogen公司)，羊抗鼠mBD2抗体(Santa cruz公司)，兔抗羊IgG抗体、DAB(Fermentas公司)，AnnexinⅤ、PI、Rnase酶(Bioscience公司)，TUNEL试剂盒(Roche公司)，细胞活力分析采用BECKMAN VICELLA AUTO 100/240进行测定。
1.2方法
1.2.1细胞裂解上清mBD2蛋白表达
收集并裂解各组转染细胞提取总蛋白，用考马斯亮蓝法蛋白定量后进行Tricine-SDS-PAGE(Tricine sodiumdodecyl sulfatepolyacry lamidegele lectrophoresis，Tricine-SDS-PAGE)电泳，分离蛋白，采用湿转法将蛋白质转移至聚偏氟乙烯(polyvinyli denedifluoride，PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭过夜后，分别用1∶100稀释羊抗鼠mBD2抗体孵育2 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，再用1∶1 000稀释兔抗羊IgG抗体孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，DAB显色检测结果。
1.2.2细胞活力测定
取对数生长期的稳定转染细胞及未转染的SiHa细胞，计数并调整细胞浓度为1×105个/mL，分别接种于12块6孔板中，每组细胞设3个复孔。在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液、5%CO2的条件下培养。细胞贴壁后于每天同一时间分别消化3组细胞，用无血清培养基重悬后加入测量杯中，于细胞活力分析仪上进行细胞活力测定，并绘制细胞活力曲线。
1.2.3 PI、AnnexinⅤ双标检测细胞凋亡
将各组细胞用胰酶消化离心收集细胞，PBS洗涤并用台盼蓝染色测定活细胞百分比，用PBS将细胞数调整为1×106个/mL。分别用含Rnase的AnnexinⅤ染色液、PI避光染色各30 min，流式细胞仪检测并记录实验结果。
1.2.4 TUNEL法测定细胞凋亡
将对数生长期细胞以1×105个/mL于6孔板中进行细胞爬片培养至细胞铺满60%左右，用冰预冷的95%乙醇于-20℃固定20 min，室温中晾干；依次在100%、95%、70%的乙醇依次脱水2 min，并采用3%H2O2甲醇溶液室温30 min，0.1%Triton X-100于4℃2 min，滴加正常羊血清，室温孵育10 min，滴加TdT及FITC标记的核苷酸混合反应液50μL，37℃60 min后终止标记反应(1×TdT Stop Buffer)，并采用DAPI复染，荧光显微镜观察凋亡结果并计算凋亡指数。凋亡指数按照在显微镜高倍镜下(×400)观察5个视野，每个视野数100个细胞，计算凋亡细胞所占百分比，即为凋亡指数(AI)。
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