2.4噬菌体的全基因组测序及亲缘性分析
由测序结果可知，噬菌体vB-EcoM-IME540的全基因组大小为170 237 bp，G+C含量为39.46%，在DNAMan上序列组成分别为A:30.7%、C:19.1%、G:20.3%、T:29.8%，由此可知此噬菌体的核酸类型为dsDNA。利用MEGA7.0.26与NCBI上基因库中的亲缘噬菌体进行基因比对，制作其系统进化树如图4，通过Blastn发现vB-EcoM-IME540与NCBI上发布的大肠杆菌噬菌体Bp7的相似性为97.44%(Bp7的GenBank登录号为NC019500.1)，并已知大肠杆菌噬菌体Bp7是肌尾科噬菌体，结合电镜形态观察可将噬菌体vB-EcoM-IME540归类为肌尾噬菌体家族。
图4噬菌体vB_EcoM_IME540的系统进化树
2.5噬菌体的裂解谱
噬菌体vB-EcoM-IME540与45株鸡大肠埃希氏菌作用，测定其裂解谱，结果发现噬菌体vB-EcoM-IME540只对其中3株鸡大肠埃希氏菌有裂解作用，裂解率约为6.67%(3/45)。
2.6噬菌体的最佳MOI
不同比例的噬菌体与宿主菌反应时，子代噬菌体的产生情况也大不相同，试验结果表明，当MOI=0.000 001时，产生的子代噬菌体滴度最高，见图5。因此，噬菌体vB-EcoM-IME540感染宿主菌的最佳MOI为0.000 001。
图5噬菌体vB-EcoM-IME540的感染复数
2.7噬菌体的一步生长曲线
裂解性噬菌体的感染过程经历吸附、穿入、合成与裂解释放4个阶段，可用一步生长曲线进行描述与展示。从图6可以清晰地看出，噬菌体vB-EcoM-IME540增殖的潜伏期、裂解期、平稳期以及裂解量；其中潜伏期大约为20 min，裂解爆发期约为130 min，裂解量约为23 PFU/cell；大约在噬菌体感染宿主菌的150 min进入平稳期，此时宿主菌全部裂解，噬菌体数量达到最高。
图6噬菌体vB-EcoM-IME540的一步生长曲线
2.8噬菌体的pH敏感性
由图7可知，噬菌体vB-EcoM-IME540在pH为4.0～13.0之间对噬菌体的影响不大，其效价无明显变化并保持在较高水平。在pH为3.0时其活性明显降低，在2.0时失去活性；在pH为13.0时，效价仍处于较高水平且明显高于3.0，说明噬菌体vB-EcoM-IME540具有强耐碱性。
图7噬菌体vB-EcoM-IME540的pH敏感性
2.9噬菌体的耐热稳定性
由图8可知，噬菌体vB-EcoM-IME540在40℃、50℃条件下作用2 h时，噬菌体效价大约下降了13.0%；60℃作用2 h，大约下降了49.0%；70℃作用20 min，效价下降了60.0%；80℃作用20 min，噬菌体失活。
图8噬菌体vB-EcoM-IME540的耐热稳定性
3讨论
噬菌体与其细菌宿主的进化密切相关，并经常提供毒力因子，使得噬菌体的研究对于理解致病株的进化具有重要意义。本试验利用噬斑形成试验与双层琼脂平板培养法从污水中分离、纯化裂解性鸡大肠埃希氏菌噬菌体，并将其暂时命名为vB-EcoM-IME540，其代表意义可参考张倩等对其的解释。
通过对噬菌体电镜观察、全基因组测序的比对和聚类分析知噬菌体vB-EcoM-IME540与噬菌体Enterobacteriaphage Bp7(有尾噬菌体目的肌尾噬菌体)亲缘性最好，其全基因组序列覆盖率高达97%。在国际病毒分类委员会(ICTV)的最新报道中，又将此噬菌体划分为dsDNA病毒。噬菌体vB-EcoM-IME540在pH为5.0～13.0时均有很高的活性，与孙利广等报道的V-EcoM-C1(pH5.0～10.0)相比，具有较强耐碱性；在50℃内具有稳定的活性，70℃下40 min仍具有活性，与本实验室分离的噬菌体EcP5相比有一定耐高温性；裂解范围与王礼伟[20]分离的EcP10相比较窄，因仅对本实验室分离保存的鸡源大肠埃希氏菌进行了裂解谱测定试验，而对其他种源大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌属是否具有裂解能力尚不清楚，需要进行后续的试验加以验证分析。感染宿主菌的潜伏期约为20 min，暴发期时间维持约130 min，裂解量23，具有较强的裂解活性；在较低的最佳感染复数0.000 001时，有较高的杀菌效率。综合以上信息，本次试验中分离的噬菌体vB-EcoM-IME540是一株能裂解鸡大肠埃希氏菌的有尾噬菌体目肌尾噬菌体科的dsDNA噬菌体，有一定的临床应用价值。
相关新闻推荐
1、福建特产糟制大黄鱼发酵原料红酒糟中短乳杆菌和酿酒酵母生长曲线测定（二）