本文研究了Latrepirdine（Dimebon）这种神经活性化合物对α-突触核蛋白（α-syn）相关神经退行性疾病的潜在治疗作用。Latrepirdine已进入阿尔茨海默病和亨廷顿病的二期临床试验，显示出增强认知和神经保护的能力。研究发现，Latrepirdine能刺激自噬，减少细胞和小鼠大脑中α-syn的积累，特别是在酵母、SH-SY5Y细胞和野生型小鼠模型中。研究表明，Latrepirdine对酵母中α-syn的细胞毒性具有保护作用，且这种保护作用涉及自噬途径的激活。在SH-SY5Y细胞中，Latrepirdine处理能减少α-syn的水平，并保护细胞免受其毒性影响。在小鼠模型中，长期给予Latrepirdine能增强自噬活性，降低大脑中的α-syn水平。这些发现支持Latrepirdine作为一种潜在的促自噬/抗神经退行性化合物。尽管Latrepirdine在美国的II期临床试验中未能成功，但研究者认为这可能与α-syn在不同人群中的神经病理学贡献差异有关。因此，Latrepirdine可能对其他突触核蛋白病症，如帕金森病和路易体痴呆，具有更好的治疗潜力。未来的研究将集中在评估Latrepirdine在这些疾病模型中的疗效，以及探索其调节自噬途径的具体作用机制。Latrepirdine的研究为开发针对α-syn相关疾病的新疗法提供了有价值的见解，并强调了进一步研究其临床应用的重要性。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪主要用于测量B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生长曲线。Bioscreen C系统通过每小时测量OD600值来监测细菌在LB培养基或修改后的MSgg培养基中的生长情况。这种监测是自动化的，可以连续记录细菌的生长情况，为研究者提供了关于细菌生长动态的详细信息。通过使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，研究者能够评估不同条件下（如在不同铁浓度的培养基中）B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生长能力。这对于理解T7SS和YukE在细菌生长和铁获取中的作用至关重要，因为铁是细菌生长的关键营养素。此外，通过比较野生型和突变株的生长曲线，研究者可以评估T7SS和YukE对细菌生长的影响。
实验结果
Latrepirdine能够保护酵母和分化的SH-SY5Y神经元免受α-突触核蛋白（α-syn）诱导的细胞毒性。这种保护作用可能是通过促进自噬途径实现的。研究表明，Latrepirdine通过激活自噬作用来减少α-syn的积累，这在酵母、SH-SY5Y细胞和野生型小鼠中都得到了证实。Latrepirdine可能是一个潜在的先导化合物，经过优化其促自噬和/或促神经原活性后，可能对包括帕金森病、路易体痴呆、快速眼动睡眠障碍和/或多系统萎缩在内的突触核蛋白病症产生临床益处。Latrepirdine在美国的II期试验失败，可能部分原因是由于对Latrepirdine潜在分子机制的了解不足，以及α-syn在不同人群中对神经病理学贡献的差异。
图1、latrepirdine可保护酿酒酵母免受α-syn的细胞毒性，但不能保护TDP-43、FUS或Htt-103Q的细胞毒性。(a)2XαSynstrain及其同源野生型(W303α)菌株在棉子糖培养基中生长到菌落中期，稀释后分别点在YPG葡萄糖平板(α-syn“关闭”)和YPG半乳糖平板(α-syn开启)上，在没有或有latrepirdine的情况下(照片摄于生长2天后30℃下)。(b)W303α或(c)2XαSyn菌株在YPG半乳糖培养基(α-syn处于“开启”状态)中，在没有或有latrepirdine的情况下生长(浓度如图所示)。(d)1XFUS、(e)2XTDP43和(f)1XHtt103Q菌株在YPG半乳糖培养基中生长(表达“开启”)，没有或有不同浓度的latrepirdine(如所示)。所有数据均为三个或三个以上独立实验的结果。
图2、latrepirdine或雷帕霉素通过诱导自噬保护细胞免受与α-突触核蛋白(α-syn)相关的细胞毒性。(a)在YTS158株系中，自噬体的成熟导致功能性碱性磷酸酶的激活。在合成培养基中生长至对数期后，在没有或存在指定浓度的拉曲霉素(如所示)的情况下，测量YTS158染色体的碱性磷酸酶活性。(b)2xαSyn菌株在YPG半乳糖培养基(α-syn处于“开启”状态)中生长，雷帕霉素存在或缺失(浓度如所示)。(c)Atg8Δ+2XαSyn培养物在YPGalactose培养基(α-syn处于“开启”状态)中，在没有或有不同浓度的雷帕霉素(浓度如所示)的情况下生长，并通过测量OD600监测生长情况。(d)将2XαSyn、其同源野生型(W303α)和ATG8基因缺失的2XαSyn(Atg8Δ+2XαSyn)置于YPG半乳糖培养基(α-syn处于“开启”状态)中，在30℃下振荡培养。使用Bioscreen仪器，每隔1小时用OD600监测细胞的生长情况。
图3、latrepirdine能刺激α-synuclein(α-syn)的分解，并保护分化的SHSY5Y神经元免受与α-syn相关的细胞毒性。使用视黄酸分化稳定表达诱导性('tet-off')人α-syn的SH-SY5Y细胞(不含多西林(dox))，并在没有(空白；不含dox)或有latrepirdine(不含dox)的情况下处理14天。(a)在10nM latrepirdine存在下处理14天的细胞被裂解，通过超速离心获得Triton X-100可溶(S100，左)和不溶(P100，中)颗粒(' '为非特异性条带)。用latrepirdine处理可减少Triton X-100可溶部分(单体减少=52.7%；s.e.m.=10.38；P<0.01)、总部分(单体减少=68.0%；s.e.m.=15.64；P<0.01)和不溶部分(聚集减少=74.8%；s.e.m.=9.397；P<0.001)中所有形式α-syn的水平，包括聚集体和可溶性单体。(b)对释放到培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)进行定量；或(c)测量SH-SY5Y细胞中四氮唑MTS的还原度，以确定在没有或存在一系列浓度的latrepirdine(如所示)的情况下细胞的存活率。(d)使用定量反转录酶-PCR分析α-syn mRNA水平，并与a-tubulin mRNA水平归一化。(e)在无dox的情况下，将过表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的诱导型SH-SY5Y细胞培养在96孔板中，24小时后用视黄酸(RA)和不同浓度的latrepirdine(如所示)处理，并量化培养液中LDH的释放。
图4、latrepirdine刺激α-突触核蛋白(α-syn)分解，同时增强自噬标记物。两个月大的野生型雄性小鼠连续21次腹腔注射3.5mg/kg latrepirdine(n=4；LAT)或等体积的空白(0.9%生理盐水；n=4；VEH)。(a)对野生型小鼠大脑中可溶性α-syn、p62和LC3蛋白水平的Western印迹分析。(b-d)Western印迹条带整合密度定量。图示为具有代表性的同胎仔鼠；
总结
latrepirdine(Dimebon；dimebolin)是一种神经活性化合物，在实验动物中与增强认知、神经保护和神经发生有关，目前已进入治疗阿尔茨海默病和亨廷顿病(HD)的二期临床试验阶段。最近有迹象表明，latrepirdine能保护细胞免受与表达可聚集的神经变性相关蛋白(包括Aβ42和γ-突触核蛋白)有关的细胞毒性的影响，基于这一迹象，研究人员试图确定latrepirdine是否能为酿酒酵母提供保护。在酵母中分别平行表达了几种神经变性相关蛋白，包括α-突触核蛋白(α-syn)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症相关基因TDP43和FUS，以及具有103个多聚谷氨酰胺扩增复制的HD相关蛋白Huntingtin(HTT基因；htt-103Q)。Bioscreen全自动生长曲线分析仪在本研究中发挥了重要作用，为研究人员提供了一个精确、高效的工具来评估Latrepirdine对酵母细胞生长和蛋白毒性的影响，从而为理解Latrepirdine的潜在神经保护机制提供了重要数据。在处理SH-SY5Y细胞或对野生型小鼠进行慢性处理后，还测定了latrepirdine对α-syn清除率和毒性的影响。latrepirdine只能保护酵母免受与α-syn相关的细胞毒性，而这似乎是通过诱导自噬发生的。进一步研究表明长期服用latrepirdine可刺激分化的SH-SY5Y神经元和小鼠大脑中α-syn的降解，同时提高自噬活性标志物的水平。正在进行的实验将确定latrepirdine在α-syn神经病理学转基因小鼠模型中消减α-syn积累的效用。研究认为latrepirdine可能是发现强效促自噬/抗神经变性化合物的新型支架，在优化其促自噬和促神经源活性后，可能会对包括帕金森病、路易体痴呆、快速眼动(REM)睡眠障碍和/或多系统萎缩在内的突触核蛋白病症产生临床益处。
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