1.2.4实时定量PCR
收集对数生长期的RAW264.7细胞，铺板密度为1.0×105个细胞/孔，接种于六孔培养板内，设置空白对照组、阳性对照组（浓度为1µg·mL−1的LPS）、人参外泌体给药组（5、10、20µg·mL−1），培养24 h，弃去原有培养基，按照分组给药，培养24 h后收集细胞，用Trizol提取总mRNA，根据反转录试剂盒说明合成cDNA。使用实时定量PCR检测IL-6、iNOS、TNF-α、MCP-1转录水平的含量。实时定量PCR扩增反应条件是94℃，30 min，1个循环；94℃，30 s，55℃，30 s，40个循环；95℃，1 min，72℃，10 min，1个循环，PCR引物序列如表1。
表1实时定量PCR引物序列
以GAPDH为内参，根据2−ΔΔCt的方法确定转录水平变化。
1.2.5流式细胞术检测人参外泌体对RAW264.7细胞极化的影响
RAW264.7细胞按照1.2.4培养，吸出原有的培养基，1000×g离心5 min收集细胞，PBS重悬，加入3µL FITC anti-mouse CD80 antibody，4℃避光孵育30 min，1000×g离心5 min，弃去上清，PBS洗涤一次，1000×g离心5 min，弃去上清，300µL重悬细胞，流式细胞术检测M1型巨噬细胞标志CD80的表达。
1.2.6 A549细胞活力测定实验
A549细胞按照密度3.0×104个细胞/孔铺板，培养24 h，吸出原有的培养基，加入相应的条件培养基，培养24 h，按照比例加入CCK-8溶液，在细胞培养箱孵育30 min，在450 nm处测定吸光度并计算。细胞存活率计算公式如下：
式中；A0为空白组的OD值；A样本为实验组的OD值；A空白为对照组OD值。
1.2.7 A549细胞周期实验
A549细胞按6.0×104个细胞/孔接种于六孔培养板内，培养24 h，弃去原有培养基，加入相应的条件培养基，培养24 h后，室温条件下，1000×g左右离心5 min，收集细胞，取细胞沉淀，按照细胞周期检测试剂盒说明书对细胞进行染色处理，利用流式细胞仪检测A549细胞周期的变化，运用分析软件FlowJo 7.6分析细胞周期变化。
1.2.8 A549细胞凋亡实验
细胞培养方法如1.2.7，使用胰酶消化，收集细胞到离心管中，1000 r/min离心5 min后弃去上清，加入400μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶染色液，混匀，37℃避光孵育20 min，用流式细胞分析仪检测人参外泌体刺激巨噬细胞极化对A549细胞凋亡的影响。
1.2.9免疫印迹
细胞培养方法如1.2.7，收集细胞到离心管内，1000×g离心5 min，吸除上清，加入适量RIPA裂解液，充分裂解细胞。使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度并调整至相同浓度，利用十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分离，恒流220 mA转膜90 min、使用5%PBS奶粉封闭1 h后，使用TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2一抗孵育过夜，回收一抗，PBST洗涤3次，二抗室温孵育1 h，PBST洗涤3次，使用iBright智能成像系统显色并观察条带，用Image J软件进行分析。
1.3数据处理
实验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，数据资料采用均值±标准差（X±SD）表示，组间数据采用单因素方差分析，P<0.05表示显著性差异。
2.结果与分析
2.1人参外泌体对RAW264.7的细胞活力的影响
RAW264.7经Tris-HCl、LPS以及不同浓度的人参外泌体处理24 h，与空白对照组相比，阴性对照组（Tris-HCl）对RAW264.7细胞没有增殖作用；在阳性对照组（LPS）浓度为1µg·mL−1时，细胞活力显著增强（P<0.01）；与空白对照组相比，随着GDNPs浓度的增加，细胞活力在浓度为5~20μg·mL−1范围内显著增强，具有明显的浓度依赖性，人参外泌体浓度为20μg·mL−1时RAW264.7的细胞活力最强（P<0.01），其次是人参外泌体浓度为10μg·mL−1（P<0.01），浓度为5μg·mL−1时细胞活力最弱（P<0.05）；与阴性对照组相比，不同浓度的人参外泌体给药组对RAW264.7细胞活力的影响显著增强（P<0.01）；与阳性对照组相比，不同浓度的人参外泌体对RAW264.7细胞活力的影响效果较弱（图1）。
2.2人参外泌体对RAW264.7细胞中炎症因子转录水平的影响
M1巨噬细胞在炎症因子分泌和抗肿瘤免疫中发挥作用，从而保护宿主免受各种细菌和病毒的侵害[24]。基于广泛的研究，有人提出M1巨噬细胞在肿瘤细胞中的高浸润与NSCLC患者的预后改善有关[25]。为了探讨人参外泌体对巨噬细胞RAW264.7细胞极化的影响，采用实时定量PCR检测巨噬细胞RAW264.7中IL-6、iNOS、TNF-α、MCP-1转录水平的表达情况，结果显示（图2），与空白对照组相比，LPS组IL-6、iNOS、MCP-1、TNF-α转录水平升高；不同剂量的人参外泌体处理后，与空白对照组相比，人参外泌体低剂量组iNOS、TNF-α转录水平显著升高（P<0.01），IL-6、MCP-1无显著差异；人参外泌体中剂量组iNOS、TNF-α转录水平显著升高（P<0.01），IL-6、MCP-1无显著差异；人参外泌体高剂量组IL-6、iNOS、MCP-1、TNF-α转录水平显著升高（P<0.01）。因此，人参外泌体可显著诱导巨噬细胞RAW264.7细胞向M1型极化。
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