摘要:目的:以耐多药奇异变形杆菌为宿主菌分离噬菌体,测定其生物学特性并评估其对鸡胸肉的抑菌作用。
方法:以耐多药奇异变形杆菌为宿主菌分离噬菌体,透射电镜观察噬菌体形态,测定噬菌体感染复数(multiplicity of infection,MOІ)、一步生长曲线和噬菌体稳定性;通过点斑法测定噬菌体宿主范围;提取噬菌体基因组并进行全基因组测序分析;采用结晶紫染色法、平板计数法评价噬菌体对生物被膜清除能力;采用平板计数法评价噬菌体对不同材料上生物被膜清除效果,以及测定4℃和25℃条件下噬菌体对鸡胸肉的抑菌能力。结果:分离获得一株长尾奇异变形杆菌噬菌体vB_PMC-PL1;全基因组分析该噬菌体属于Demerecviridae家族Novosibvirus属,未发现与毒力、抗生素耐药性和整合酶相关的基因;vB_PMC-PL1最佳MOІ为0.1、潜伏期为20 min、裂解量为106 PFU/cell;在pH 3~11、4~50℃条件下活性稳定;宿主范围显示,vB_PMC-PL1不但能裂解奇异变形杆菌,还能裂解普通变形杆菌;平板计数结果显示vB_PMC-PL1能有效清除不锈钢和高密度聚乙烯上形成的细菌生物被膜。在4℃条件下vB_PMC-PL1处理6 h后,鸡胸肉中细菌数量分别减少0.95(lg(CFU/g))(MOІ=1 000)和1.01(lg(CFU/g))(MOІ=10 000);在25℃条件下vB_PMC-PL1处理9 h后细菌数量分别减少1.50(lg(CFU/g))(MOІ=1 000)和1.67(lg(CFU/g))(MOІ=10 000)。
结论:vB_PMC-PL1能够裂解奇异变形杆菌和普通变形杆菌,并对奇异变形杆菌生物被膜具有良好的裂解活性和清除作用,这不仅丰富了变形杆菌噬菌体资源库,而且为变形杆菌噬菌体鸡尾酒的开发与食品生物防控应用提供了参考。
食源性致病菌和条件性致病菌引起的食品污染是导致食源性疾病的重要原因之一,严重威胁公共卫生健康安全。奇异变形杆菌是一种条件性致病菌,存在于鸡、猪等多种动物肠道内,在屠宰加工过程或食品加工过程中极易污染动物性产品,误食污染的肉制品可引起食物中毒;临床上,奇异变形杆菌会导致患者尿路感染、尿路结石和菌血症等病症,对人类健康构成威胁。根据我国近年来文献报道,由奇异变形杆菌引起的食物中毒案例正逐渐增多,奇异变形杆菌已成为引起我国食物中毒事件的重要致病菌之一。目前,已有研究报道,生鸡肉中分离出的耐药奇异变形杆菌比例远高于猪肉、牛肉等动物性产品。作为鸡肉、猪肉等肉类制品消耗量最多的国家之一,防控由奇异变形杆菌引起的动物性食品污染至关重要。
噬菌体是裂解细菌的病毒,广泛地存在于环境中,因其独特的宿主特异性、安全性以及对人类与动物肠道中正常菌群无害,有望作为控制食源性致病菌的替代工具。目前,裂解性噬菌体在食品安全方面研究正逐渐增多,如Zhang Yue等通过热处理与耐高温噬菌体LPEK22相结合的方式清除牛奶和牛肉香肠中的大肠杆菌O157:H7;此外,Byun等使用噬菌体鸡尾酒成功清除了单核细胞增生李斯特氏菌在不同食品接触材料上形成的生物被膜。美国食品药品监督管理局已批准几种商业化噬菌体产品用于控制食品中单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7。因此,噬菌体作为生物制剂在食品行业中展现出巨大的应用潜力。
本研究以耐多药奇异变形杆菌为宿主菌,分离鉴定出一株奇异变形杆菌噬菌体,对该噬菌体生物学特性和全基因组进行分析,评价该噬菌体对细菌生物被膜的清除能力以及控制鸡胸肉中奇异变形杆菌污染的能力。本研究旨在丰富变形杆菌噬菌体资源库,以期为开发变形杆菌噬菌体鸡尾酒制剂以及动物性食品生物防控提供参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
本研究中用于噬菌体分离的宿主菌为耐多药奇异变形杆菌PM B2;用于噬菌体宿主鉴定的奇异变形杆菌和普通变形杆菌以及受试其他菌株均为农业农村部东北寒区牛病防治重点实验室(部省共建)保藏;污水样品采自黑龙江省大庆市城市污水。
Luria-Bertani(LB)培养液、琼脂青岛海博生物技术有限公司;SM缓冲液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、96孔细胞培养板武汉赛维尔生物科技有限公司;鸡胸肉、高密度聚乙烯东莞好用塑胶材料有限公司;304不锈钢片上海甸灿不锈钢制品有限公司。
1.2仪器与设备
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