根据GenBanK中发表的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.multocida）HN06株（登录号为NC017027）的ompH核苷酸序列设计合成一对特异性引物，将PCR扩增获得的牦牛源P.multocida C47-8的ompH基因片段连接到pMR10载体上，构建了C47-8株ΔompH缺失株互补质粒pMR10-ΔompH，并将该质粒电转化至C47-8ΔompH缺失株中，成功获得其互补菌株。在此基础上，对C47-8亲本株、ΔompH缺失株以及互补株的生物学特性进行研究。形态学观察结果表明，3株菌的生长形态无差异；生化试验结果表明，除了缺失株发酵蕈糖、硝酸盐试验呈现阳性外，3株菌的其余生化特性未发生改变；体外生长曲线表明亲本株C47-8的生长速度比缺失株和互补株的生长速度慢，说明ompH基因对C47-8的生长有显著影响。本试验为深入研究P.multocida的致病机制以及研制安全有效的基因缺失减毒活疫苗奠定了基础。
体外生长曲线的测定3个菌株的OD600值，绘制细菌体外生长曲线，每个菌株做3个重复，用SPSS19.0软件进行分析，并根据生长曲线测定出细菌的代时。
体外生长曲线的测定将P.multocida菌液每隔1 h测定3次OD600值，将得到的数据用SPSS19.0软件进行统计学分析，并绘制体外生长曲线，结果见图。
C47-8亲本株、缺失株和互补株体外生长曲线的测定结果
从图可知，亲本株生长速度较慢，而缺失株和互补株则生长速度较快，由此可以确定ompH基因明显影响了C47-8的生长。
2.3.4根据生长曲线测定出细菌的代时（G）C47-8亲本株代时为1.248 h，缺失株为0.727 h，互补株为0.765 h。表明C47-8亲本株代时最长，互补株居中，缺失株最快，说明ompH基因的缺失影响了P.multocida的生长。
讨论
目前，青海省预防牦牛出血性败血症主要使用的是20世纪80年代从黄牛体中分离获得的C45-2全菌灭活苗，但免疫效果差。随着各种病原体反向遗传操作技术体系的建立，越来越多的人将注意力转移到了筛选与疾病流行相符合的地方血清型靶向缺失株，期望通过缺失关键的毒力相关基因，使毒力减弱，但保持免疫原性从而达到控制疾病的目的。
本研究前期选择ompH基因作为缺失目标，选用具有阳性Amp抗性基因和蔗糖阴性筛选基因sacB的pEX18AP质粒为缺失载体，成功构建了
3株无抗性基因标记的P.multocida的ompH基因缺失株，构建过程中没有插入新的基因，避免了外源基因对缺失菌株的干扰和潜在的生物安全危险，为基因缺失疫苗的研究提供了可能。
本研究在对牦牛源P.multocida C47-8株外膜蛋白H基因的缺失株和互补株的形态学特性观察研究中发现3个菌株菌落形态没有发生改变，说明ompH不参与菌落形态的维持。生化试验发现C47-8缺失株发酵蕈糖，硝酸盐试验呈阳性，与亲本株和互补株不同，其原因可能是ompH蛋白对P.multocida起着负调控作用。该菌分解蕈糖可以为细菌在宿主细胞中的存活提供相应的碳源和氮源，而ompH基因的缺失使P.multocida的转录不再受到抑制，为细菌供应充足的碳源和氮源，以便细菌的大量繁殖。体外生长曲线表明缺失株和互补株的生长速度比亲本株快，并且缺失株和互补株的菌体繁殖活力比亲本株强，说明ompH基因对C47-8的生长有明显影响，但是该基因具体通过什么方式和途径影响菌体生长？其原因有待于进一步研究。
ompH蛋白作为交叉保护的一种良好的候选抗原受到研究者们越来越多的关注。本试验构建出的牦牛源P.multocida C47-8ΔompH互补株生物学特性试验发现，ompH基因的缺失导致产生了新的生物学表型，为下一步研制P.multocida基因缺失疫苗提供了重要的理论依据。
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