1.7外毒素含量测定
在1.6中测定OD600 nm值时，同时吸取适量菌液，12 000 r/min离心10 min，用0.22μm细菌滤器过滤，制得外毒素粗提取液。分别测定OD280 nm和OD260 nm值，根据蛋白浓度经验公式计算不同培养时间点培养液的外毒素蛋白质含量(ρ)。
ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm
1.8同源性分析将测得的牦牛源产气荚膜梭菌16S rRNA序列与NCBI中GenBank数据库进行比对，在对比结果中选取来自亚洲地区且相似度较高的动物菌株序列，下载其序列后利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。
1.9 MIC测定
挑取单菌落接种于梭菌增菌液体培养基中，待菌液浓度生长至0.5个麦氏浊度(OD600 nm：0.8～1.3)，用稀释涂布平板法均匀涂布于MH培养基上，采用E-test法测定牦牛源产气荚膜梭菌对8种常用抗菌药物(头孢噻肟、青霉素、复方新诺明、氨苄西林、四环素、多黏菌素B、红霉素、庆大霉素)的MIC。MIC纸条环尖所对应纸条上的数值就是对应抗菌药对细菌的最低抑菌浓度，根据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的《抗菌药物敏感性试验标准》对测定结果进行判定。
2结果
2.1牦牛源产气荚膜梭菌生长情况
观察复苏菌株在血琼脂平板上生长为表面光滑、半透明、圆屋顶样菌落并产生双溶血环(图1)；在梭菌增菌培养基中生长后培养基液体由透亮的黄色变浑浊；革兰染色镜检显示，牦牛源产气荚膜梭菌为革兰阳性大杆菌，菌体呈直杆状，两端钝圆，常单在或成双排列(图2)。
图1牦牛源产气荚膜梭菌在血平皿上的生长情况
图2牦牛源产气荚膜梭菌革兰染色镜检(1 000×)
2.2生化鉴定
牦牛源产气荚膜梭菌生化鉴定结果见表2。该菌株在葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、卵磷脂酶、乳糖、酪蛋白生化管中呈阳性反应；在脂酶和吲哚生化管中呈阴性反应。该菌株在石蕊牛奶中牛乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，上升到培养基表面，且能发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“汹涌发酵”现象。牛乳发酵试验结果符合产气荚膜梭菌基本生化特征。
表2牦牛源产气荚膜梭菌生化鉴定
2.3 PCR鉴定
PCR产物凝胶电泳结果见图3，16S rRNA PCR产物在约1 456 bp处出现条带，测序比对结果确定其为产气荚膜梭菌；毒力分型PCR产物在196 bp和325 bp处出现条带，检测到β和α毒素，与C型产气荚膜梭菌毒素相符合，可确定菌株qinghai-12为牦牛源C型产气荚膜梭菌。
图3 16S rRNA(A)和毒力分型(B)的PCR扩增
2.4生长曲线测定
牦牛源C型产气荚膜梭菌生长曲线见图4。该菌株在接种后0～4 h内处于迟缓期；4～8 h处于对数生长期；8～24 h为生长平衡的稳定期；在测定期间内未测量到衰亡期。
图4牦牛源C型产气荚膜梭菌生长曲线
2.5外毒素含量测定
牦牛源C型产气荚膜梭菌不同时间点外毒素蛋白含量见表3，在培养10 h后，该菌株所产毒素的蛋白质含量达4.173 mg/mL，且随着时间的推移蛋白质含量持续增长。结果表明，牦牛源C型产气荚膜梭菌所产外毒素蛋白质在10 h时达到最佳产毒时间，含量达4.173 mg/mL。
表3牦牛源C型产气荚膜梭菌毒素蛋白含量