仿刺参(Apostichopus japonicus)是我国重要的经济海水品种。自2003年开展“北参南养”试验以来，仿刺参养殖在南方取得蓬勃发展，福建省已成为我国南方重要的仿刺参养殖产区，在“北参南养”过程中，疾病问题一直是制约养殖业发展的难题。本研究从仿刺参肠道内容物中分离获得一株植物乳杆菌，对菌株生长特性、产酸能力等益生特性进行分析，为水产用益生菌制剂研发提供备选菌株，为更好地开发和应用益生菌制剂提供理论支撑。
实验步骤
细菌浓度和吸光度值的线性相关曲线
以无菌培养液作为空白对照，取处于对数生长期的L.plantarum培养液。在波长600 nm分别测定系列稀释菌悬液的OD值，制作菌浓度与OD值的关系曲线，获得线性关系方程式。
不同条件下培养菌株HY21
MRS液体培养基分别调节不同pH和不同NaCl添加量，分别接种2%种子液，在不同温度条件下进行恒温培养24 h，测定其OD600值。根据1.2线性方程式，计算结果绘制图表。
菌株的生长曲线及产酸能力的测定
将L.plantarum HY21培养液以2%接种于MRS液体培养基，30°C恒温厌氧培养。前12 h每1 h取样一次，后20 h每2 h取样一次。测定培养液在600 nm处吸光度值并测定培养液pH。
结果与分析
细菌浓度和吸光度值的线性相关曲线
L.plantarum HY21的细菌浓度与OD值之间相关线性关系的标准曲线如图1所示。在波长为600 nm下，当吸光度值介于0.054 0–0.848 6之间时，L.plantarum HY21细菌浓度与吸光度值之间线性关系良好，建立的回归方程为Y=0.027 34X+0.039 11(R2=0.997 6)。
植物乳杆菌的培养条件和产酸能力
由图2所示，当pH 4.0–9.0时，植物乳杆菌HY21生长迅速，能大量繁殖。菌株在强酸强碱环境下生长状态明显受到抑制，对pH 4.0和pH 10.0等环境具有一定的耐受性。在15°C低温条件和55°C高温条件下，生长完全受到抑制，在20–45°C条件下，菌株能够良好生长。在添加1.0%、1.5%NaCl的MRS培养基中，菌株不受影响能正常生长。当添加NaCl含量大于3.0%时，生长效果逐渐次之。当NaCl添加量达到8.0%时，生长受到抑制，菌体无法增殖。在接种2 h后，迅速进入对数生长期，9 h后生长速度变缓，14 h时到达最大生长量。0–10 h内，菌液pH从5.6快速下降至3.8。18 h后菌液pH变化趋于平缓，基本稳定在3.6左右。L.plantarum HY21可以在14 h内达到最大生长量和较低的pH。综上所述，L.plantarum HY21在pH 5.0–8.0的环境中生长状态最佳，耐温范围较广，14 h内达到最大生长量和较低的pH。
图1植物乳杆菌HY21的细菌浓度-吸光度的线性相关曲线
植物乳杆菌对模拟胃肠液、海盐溶液、胆汁的耐受性
表1比较了L.plantarum HY21在不同外环境胁迫下的存活情况。在pH 3.0的人工胃液和pH 6.8的人工肠液中3 h后，L.plantarum HY21存活率分别为118.83%±7.42%和103.85%±3.42%。在不同pH的人工胃肠液中处理不同时间后，所检测到的L.plantarum HY21活菌数随着pH降低而明显减少；而且经pH 2.5处理，随着时间延长活菌数显著减少；但经pH 3.0处理，随时间延长菌数没有明显变化。植物乳杆菌HY21在3%海盐溶液中处理不同时间后，所检测到的活菌数随时间延长并没有明显差异；在处理16 h后存活率仍为97.58%±7.14%。随着胆汁浓度的增加，植物乳杆菌HY21的活菌数逐渐减少，存活率逐渐降低；在2.5%、5.0%、10%胆汁环境下，存活率分别为89.43%±1.27%、87.74%±6.23%、68.11%±7.98%。
图2不同初始条件下植物乳杆菌HY21的生长量(A−C)和植物乳杆菌HY21的生长与pH变化曲线(D)
表1植物乳杆菌HY21在不同溶液中的存活率(平均值±标准误，n=3)
讨论
不同来源植物乳杆菌的生长特性
对比不同来源植物乳杆菌的生长曲线与产酸曲线发现，大部分植物乳酸杆菌的生长延滞期较短，大多在2 h后迅速进入对数期，且产酸较多，大多数进入稳定期时pH小于4.0[14-19]。本试验菌株HY21的生长曲线和产酸曲线与猪源植物乳酸杆菌GF103[14]的研究结果相似，2 h后进入对数期，9 h进入稳定期，稳定后pH在3.6左右，至20 h进入稳定期末期，菌量才出现下降。该结果表明，菌株HY21有较好的稳定性和产酸能力。培养后期可以调节pH和添加营养物质等方式，在短时间内获得大量发酵产物和菌体。
表2植物乳杆菌HY21对4株病原菌的抑制作用
图3植物乳杆菌HY21对4株病原菌的抑制平板
图4植物乳杆菌HY21清除3种自由基的能力和还原力的比较分析不同小写字母之间表示差异显著，相同字母之间表示差异不显著
温度是微生物生命活动中重要的环境因子，当温度改变时，微生物必须通过调节脂类的组成、胞内酶的活性、蛋白质的合成、基因调控和RNA的合成以适应环境温度的变化。温度不仅影响乳酸菌的生长，还影响代谢产物的产量和质量。Fu等[17]从泡菜中分离出植物乳酸杆菌ZJ2868，该菌在20–45°C的温度范围内均能正常生长，属于中温性乳酸菌。菌株HY21在30°C时生长效果最佳，在20–45°C能够良好生长，与温度对菌株ZJ2868的生长影响规律一致，也属于中温性乳酸菌。
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