间充质干细胞从骨髓、脂肪、子宫内膜息肉、牙髓、外周血、胎盘、子宫内膜、脐带血、脐带华通氏胶等组织中提取出，其致瘤性低，临床应用相对安全。其中，脐带华通氏胶具有来源易得、可在无创且无菌的条件下获取、分离方法简便、分离的间充质干细胞数量多且增殖能力强等优势。并且，脐带间充质干细胞具有低免疫原性，不会引起宿主的免疫排斥；安全性良好，不具致瘤性；不存在伦理争议。这些优点均为后期的临床应用及转化提供了便利性与安全性的保障。
人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs）因其来源广泛、增殖能力强、免疫原性低等优点，在临床应用中备受关注。由于从机体组织分离得到的hUMSCs数量有限，而传统的二维培养所得的细胞数有限，且培养过程中因使用胎牛血清（FBS）而不符合临床应用要求，故需建立临床级人脐带间充质干细胞（hUMSCs）规模化扩增技术。此外，hUMSCs成骨分化能力低，限制了其在疾病治疗中的应用，因此有必要增强hUMSCs成骨分化能力。
在人体中，骨骼系统将各种骨系统性的排列起来，为机体提供结构稳定性和保护器官的作用。膝关节作为一个负荷承载器，作用是使上肢保持稳定，并帮助人完成各种日常活动，如行走、跑步、跳跃、玩耍等。膝关节位于髋关节和踝关节之间，是人体内一种最大、最复杂的下肢关节。由三个突出的关节骨（股骨、胫骨和髌骨）组成，支持人体的几乎所有活动和全部重量。
骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是最常见的关节疾病，表现为局部退行性病变，可能主要发生在一个关节处或涉及多个关节病变。它较常发生在较大的承重关节如膝关节和髋关节等部位，以及手和脊柱等小关节处。OA影响全球估计超过3亿人，其中在美国估计有超过5000万人，中国有2610万人（1990年），后上升至6120万人（2017年）。骨性关节炎影响了全球约10%的男性和18%的女性，其中女性骨关节炎患病率高于男性。膝关节处的骨性关节炎（Knee Osteo arthritis,KOA）是全球各种肌肉骨骼疾病中最常见的关节疾病，约占全球骨性关节炎总负担的85%。
KOA的临床特征是关节功能障碍、疼痛、僵硬、活动受限。其中最突出的是疼痛，僵硬在早上或长时间坐着后更严重，同时伴有不稳定（关节屈曲或摆动）、抽搐和僵硬，导如步行、运动和舞蹈等活动能力丧失。疼痛在疾病发展过程的早期与关节使用有关，但随着时间的推移可能变得难以预测。10%的KOA患者无法进行日常生活活动，甚至导致身体残疾。就残疾负担而言，2015年骨关节炎占全球残疾生活年限（Global Years of Living withDisability）的3.9%，到2020年，预计它将成为全球残疾生活年限的第四大原因。另外，骨关节炎通常会引起并发症，这可能是缺乏体力活动、药物毒性和炎症细胞因子的联合作用。许多骨关节炎患者，特别是老年患者（65岁及以上），将会伴有一种或多种并发症。
骨关节炎治疗的基础包括运动、适当的体重减轻，以及对那些没有禁忌症的患者辅以局部或口服非甾体抗炎药（NSAIDs）。其有效的非手术治疗选择有限。骨关节炎症状晚期和结构损伤的患者只能进行关节置换术，且当前由OA引发的髋关节和膝关节置换术率增加，强调对有效非手术治疗的迫切需要。
尽管基于MSCs的细胞疗法有望用于疾病治疗，但在将该细胞进行广泛的临床应用之前，仍存在诸多挑战。由于MSCs在诸如骨髓、脐带血、滑膜、牙髓、胎盘、脐带等组织中的存在比例较低，因此对于许多临床适应症的治疗应用，必须将MSCs分离并进行体外扩增。为满足临床应用要求，离体扩增的这一阶段应在符合良好组织培养规范和良好生产规范（GMP）要求的培养条件下完成，在MSCs扩增过程中不引入异源成分，且在严格的封闭操作系统中进行，保证MSCs产品的安全性。但是，直到现在，胎牛血清（FBS）仍作为大多数细胞培养的补充剂，FBS中异源成分的存在使经FBS培养的MSCs输入人体内可能引起机体免疫反应。
因此，在保证无异源物质污染的基础上，建立有效的MSCs体外扩增体系是一个亟待解决的问题。
现有技术中已有的干细胞的制备来源有限，且在干细胞的分离培养过程中涉及多种蛋白酶以及动物源性的培养材料的使用，这对后续制备获得的干细胞制剂的进一步应用带来了较大的障碍，存在制备的干细胞使用受限的不足。
针对现有技术中干细胞制备方法不足的问题，提供一种新的干细胞的制备方法。本文提供的P1代和P8代细胞均具有良好的生长曲线和增殖能力，说明采用上述方法制备的人脐带间充质干细胞具备较强的自我更新和繁殖能力。
将制备获得的人脐带间充质干细胞应用于治疗膝骨关节炎的小鼠，可以显著抑制小鼠骨赘形成，能显著促进关节间隙扩大，抑制硬化骨产生，有效的减轻骨质增生的作用，并且加快软骨分层，促进软骨生长增加，有利于膝骨关节炎的治疗和改善。
脐带间充质干细胞的制备方法及步骤：
1）取新鲜脐带，分离获得华通氏胶并置于细胞裂解液中浸泡；
2）处理后的华通氏胶用生理盐水洗涤，置于培养皿中，CO2
细胞培养箱放置2h后，向组织块中加入完全培养基培养；
3）每隔7天左右，观察细胞并进行换液补液，当细胞融合度达到85%以上时，将贴壁的脐带组织重新平铺于新的培养皿，进行二次组织贴壁培养；
4）加入含有胰蛋白酶替换物的PBS处理细胞团，待细胞分散后，离心后采用完全培养基重悬，获得第一代hMSCs。
脐带间充质干细胞增殖性实验
将P5和P8代人脐带间充质干细胞以104个细胞/孔的密度分别接种6块96孔板，从细胞接种到96孔板后的24 h开始，采用CCK-8法测定，测量7天，取6块培养板的测定平均值绘制出生长曲线。测定结果参见下表1，对应的生长曲线图参见图1。
表1：P5和P8代人脐带间充质干细胞的生长曲线测定数值
图1P5和P8代人脐带间充质干细胞生长曲线图
从测定结果来看，P5和P8代人脐带间充质干细胞在前4天均呈现明显的对数生长，其中第四天的细胞密度约为第一天的4倍，后期，由于空间和营养的限制，细胞不再快速增殖，进入滞长期，此外，P5和P8代细胞的生长曲线呈现高度拟合，且每天的吸光度数值之间没有统计学差异，说明所检测的P5和P8代人脐带间充质干细胞能够在体外保持增殖活力并且具有相似的增殖能力与生长规律，进一步表明，采用本方法制备的人脐带间充质干细胞，不同代之间，生长规律近似，性质稳定，具备良好的增殖规律以及增殖速度。
相关新闻推荐
1、益生菌靶向肠道微生物群，改善血脑屏障及其相关疾病的研究（三）