2结果与分析
2.1 rJEV-EI176R病毒的生物信息学分析
2.1.1 E基因的凝胶电泳及测序分析
以重组病毒rSA14和rJEV-EI176R的基因组cDNA为模板扩增E基因，得到的基因片段大小为1 500 bp(图1)，符合预期大小。经过测序和DNA‐MAN 6软件比对发现，rJEV-EI176R病毒的E蛋白2394相对于rSA14，只在176位点氨基酸处发生了I-R的变化(图2)。
2.1.2 rJEV-EI176R的E蛋白氨基酸序列特征分析
对rSA14和rJEV-EI176R的E蛋白的氨基酸序列进行分析(表2)可知，其氨基酸数量均为500个。但由于进行了I-R的突变，分子的重量、原子的组成占比发生了细微的变化，rJEV-EI176R的带正电荷残基增加了1个，理论等电点升高了0.37，由7.31升高到了7.68；不稳定指数升高了0.39，由25.92升高到了26.31。
2.1.3 rJEV-EI176R的E蛋白二级结构分析
利用SOPMA在线预测工具对rSA14和rJEVEI176R的E蛋白进行二级结构分析，如图3所示，在176位点经过I-R突变后，E蛋白α螺旋、β折叠、延伸链以及无规则卷曲的数量及占比均发生了改变。在rSA14病毒E蛋白中，α螺旋数量为110、占比22%，β折叠数量为30、占比6%，延伸链数量为156、占比31.2%，无规则卷曲数量为204、占比40.8%；与rSA14相比，在rJEV-EI176R病毒E蛋白中，α螺旋数量减少8个，占比下降1.6%(102,20.4%)、β折叠数量增加5个，占比增加1%(35,7%)、延伸链数量增加2个，占比增加0.4%(158,31.6%)以及无规则卷曲数量增加1个，占比增加0.2%(205,41%)。说明E蛋白176位点I-R的突变能够引起E蛋白的二级结构发生变化，二级结构的变化能够影响蛋白质的空间结构，导致蛋白质的功能发生改变。
2.1.4 rJEV-EI176R的E蛋白氢键连接分析
经Pymol作图分析176位点的I突变为R后，由非极性氨基酸变成了极性带正电荷的氨基酸，突变前与突变后E176位点氨基酸与附近氨基酸有了不同的连接，rSA14病毒E蛋白176位点与E188L有2个氢键的连接，rJEV-EI176R病毒E蛋白176位点与E168T有1个氢键连接，与E188L有2个氢键连接(图4)。
2.2 rJEV-EI176R的生长特性分析
2.2.1 rJEV-EI176R的生长曲线及蚀斑测定
倍比稀释E蛋白真核表达质粒，初始质粒拷贝数为26 800，计算出标准曲线方程为Y=-3.33X+30.33，R2为0.9。2种病毒以MOI=0.01接种BV-2细胞，收取细胞上清液进行荧光定量检测，绘制0~72 h的生长曲线，如图5A所示，rSA14和rJEVEI176R病毒在0~48 h之间增殖量有明显的上升，其后略有下降，但保持在一个相对稳定的状态。2株病毒的生长曲线并没有显著的差异，说明突变不影响2株病毒在BV-2细胞上的增殖。将BHK-21细胞接种至6孔板，长满后进行蚀斑实验，并用结晶紫染色，随后6孔板中出现2株病毒的蚀斑形态，用卡尺测量2株病毒蚀斑的直径(图5B)，如图5C、5DC图1 E基因的电泳乙型脑炎病毒囊膜蛋白I176R位点突变株的生物学特性比较研究所示，发现rSA14和rJEV-EI176R 2株病毒的蚀斑形态大小基本一致，说明突变并不影响2株病毒生长形态。
2.2.2 rJEV-EI176R在不同细胞中的增殖及吸附情况分析
用rSA14病毒和rJEV-EI176R病毒分别感染BV-2、U-251、Vero和BHK-21细胞，并在2 DPI时进行间接免疫荧光分析。如图6A、6B所示，所有的细胞均能在NS3蛋白多克隆抗体下显示绿色荧光，说明rSA14和rJEV-EI176R病毒能够感染不同来源的神经细胞和不同来源的肾细胞，突变并没有导致病毒失去在这4种细胞中的复制能力。同时，吸附实验结果表明(图6C)，在BV-2和U-251细胞上，rJEV-EI176R病毒的结合能力更高，且显著高于野生型rSA14病毒(P＜0.05)。rSA14和rJEVEI176R病毒在Vero细胞上的结合能力相似，在BHK-21细胞上，rJEV-EI176R病毒的结合能力更高，以上结果显示，E176I-R的突变对于JEV与神经细胞的结合有显著的影响，但对于不同种属、不同类型的细胞具有不同的吸附特性。说明176位点突变影响了病毒与不同细胞的吸附能力。
2.3 rJEV-EI176R诱导BV-2细胞炎性水平检测
rSA14和rJEV-EI176R病毒感染BV-2细胞后IL-6、TNF-α、IP-10的表达量具有显著差异。如图7A、7C所示，IL-6、TNF-α和IP-10在rSA14和rJEVEI176R病毒的刺激下均显著上调(P＜0.05)，证实病毒能够引起BV-2细胞因子上调。同时，rSA14病毒引起IL-6、TNF-α和IP-10的表达量显著高于rJEV-EI176R病毒(P＜0.05)，说明rSA14病毒感染能够导致BV-2细胞更严重的炎症反应。
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——摘要、前言
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——材料与方法
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——结果与分析
乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——讨论、结论