草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，一种草食性鱼类，饲养成本低，养殖地域广，是我国淡水养殖的重要品种，除新疆，青藏高原外，在我国各地均有养殖，也是广东省的淡水主养品种之一。但是草鱼养殖期间易发生病害问题，其中以病毒性出血病最甚，对我国草鱼养殖业造成巨大损失。草鱼呼肠孤病毒(Grass carpreovims，GCRV)感染导致的草鱼出血病已经成为制约草鱼产业健康发展的重要因素之一。目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是免疫预防。鱼类细胞系正是研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要研究体系。因此，建立草鱼细胞系，是进行草鱼呼肠孤病毒的分离与鉴定，研究其致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。
迄今为止，虽然有草鱼肾脏细胞系(中国水产科学研究院长江水产研究所，左文功，水产学报，1986,10(1):11-16)、草鱼吻端组织细胞株ZC-7901及其亚株ZC-7901S1(浙江省淡水水产研究所，张念慈，水产学报，1981,5(2)：111-119)吻端成纤维细胞系PSF(中国水产科学研究院珠江水产研究所，国家科技成果，2005，S943.112；S941.411)、草鱼尾鳍组织二倍体细胞系(中国科学院水生生物研究所，魏彦章，水生生物学报，1986,10(3):293-294)、草鱼囊胚细胞系、肝细胞系等几个细胞系的文献报道，但是仍未见脑细胞系的报道。
草鱼脑组织的制备：
鲜活草鱼于75％酒精中浸泡1～2min，置于超净台中无菌取下脑组织，用PBS漂洗2遍后，置于5ml的无菌青霉素小瓶中(含5％(v/v)胎牛血清的M199培养液)，用手术剪将其剪成约1mm3
碎块，加入5ml PBS收集至15ml离心管，1000rpm离心3min，离心收集组织块后弃去上清，重复一次。加入组织块约10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃消化20min。加入培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入5ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，离心去上清，收集细胞。纱网上的组织块可以再重复消化，过滤。用含20％(v/v)FBS(胎牛血清)的M199培养液充分悬浮细胞，即得到草鱼脑细胞悬液，将细胞悬液均匀接种于25cm2的培养瓶中，培养条件为27℃，5％CO2。
草鱼脑细胞培养液的配制：
M199培养液(GIBCO)(pH值为7.0～7.4)加入20％(v/v)胎牛血清(Hyclone)。细胞传至10代以后，胎牛血清添加量减至10％(v/v)。
草鱼脑细胞原代培养的启动：
用细胞培养液悬浮细胞，于27℃，5％CO2中培养；脑细胞迁出后，每隔3～5天换液一次，以去除未贴壁的组织和死细胞；细胞在完全培养液中生长状态良好，增殖明显。
草鱼脑细胞的培养条件研究
草鱼脑细胞最佳培养基的确定
选择DMEM、M199、MEM、L-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％(v/v)的FBS制备细胞培养液。调整细胞密度为4×105个/mL，四种培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。确定其最适培养基为M199或L-15培养基。
草鱼脑细胞最适血清浓度的确定
分别配制FBS浓度为5％、10％、15％、20％(v/v)的培养液，调整细胞密度为4×105个/mL，四种血清浓度培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。
草鱼脑细胞最适培养温度的确定
选择15℃、22℃、27℃、32℃四个不同培养温度，使用添加10％FBS的DMEM培养液，调整细胞密度为4×105
个/mL，细胞悬液按2.5mL/孔的量接种于6孔板并置于于四个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7d，连续计数7次，绘制其生长曲线。
草鱼脑细胞群体倍增时间测定
取60代细胞接种于六孔板，使其终浓度为4×105细胞/mL，置27℃培养。每隔1d收集3个孔中的培养细胞，混匀后用Countstar细胞计数仪进行细胞计数，连续测定7d。以培养时间(h)为横坐标，细胞浓度(细胞/mL)为纵坐标，绘制生长曲线。实验重复3次。根据公式T＝t×lg2/lg(Nt/N0)计算细胞的群体倍增时间，经计算第60代CIB群体倍增时间为31.664h，细胞生长状态良好。其中，N0为接种细胞数，Nt为时间t后的细胞数。
草鱼脑细胞对草鱼出血病病毒(GCRV)的敏感性：
以第60代草鱼脑细胞为对象，检测草鱼出血病病毒(GCRV)对该细胞的敏感程度。密度为4×105个mL-1细胞接种24小时后，将病毒103TCID50/mL溶液加入细胞培养瓶中，1小时后，移去病毒溶液，更换新鲜细胞培养液，继续培养，约2天后，观察到细胞病变效应(CPE)后，将细胞做电镜切片观察。透射电镜结果显示，在草鱼脑细胞系中观察到大量GCRV病毒粒子。
草鱼脑细胞CIB最适培养基为M199培养基，最适胎牛血清浓度为10％，最适生长温度为27℃，生长曲线正常，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒感染细胞系可以检测到病毒粒子的存在，证实草鱼脑细胞系可以直接应用于病毒感染试验及疫苗研究。同时，该细胞对罗非鱼湖病毒TiLV敏感，可用于罗非鱼湖病毒病原学研究及罗非鱼湖病毒病防控产品开发。
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