单核细胞增生李斯特菌，简称单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)，是不形成芽胞的革兰阳性(G+)短杆菌，具有需氧或兼性厌氧特性，兼性胞内寄生，作为一种食源性病原菌(foodborne pathogen)，可导致李斯特菌病(listeriosis)，患者表现为胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产或死胎等，病死率(case fatality rate)高达20%−30%[1-3]。Lm能低温生长，最低生长温度可达−0.4℃[4]，对冷藏食品的安全构成严重威胁，并对人类健康造成潜在的危害。目前，Lm低温生长的具体机制不明，研究Lm低温生长机制能为防控李斯特菌病的暴发提供理论依据。
Durack等[5]通过分析处于低温4℃条件下生长的Lm菌株的转录组数据发现，与鞭毛合成相关的基因表达明显地下调，处于被抑制状态；运动性试验结果显示，在4℃培养条件下菌株运动圈的直径显著小于25℃培养条件。Cordero等[6]比较了Lm在低温8℃生长条件下生长快的菌株与生长慢的菌株的运动性，发现生长快的菌株的运动性显著弱于生长慢的菌株；转录组数据显示生长快的菌株的鞭毛合成基因表达显著下调。所以，Lm能低温生长与抑制鞭毛基因表达以减少鞭毛的合成有关，其具体机制未见报道。
Lm鞭毛基因中的flaA是个单顺反子，其编码鞭毛丝蛋白FlaA，其他鞭毛基因主要分布在394、397和398这3个操纵元上(图1)[6-7]。Lm在机体环境或37℃培养条件下，鞭毛基因被阻遏蛋白MogR抑制，不产生鞭毛，无运动性[8-9]；当Lm处于外界环境或20−30℃培养条件时，MogR被抗阻遏蛋白GmaR抑制，MogR对鞭毛基因表达的抑制被解除，Lm合成鞭毛，能运动[10-11]。因此，我们推断Lm低温生长时鞭毛量减少可能与MogR抑制鞭毛基因表达有关。为了验证此推断，本文以Lm ATCC 19115为亲本株，构建阻遏蛋白MogR基因缺失株ΔmogR及其回补株cΔmogR，同时还构建了鞭毛丝蛋白FlaA基因缺失株ΔflaA(作为无鞭毛对照株)及其回补株cΔflaA，测定各菌株在低温下的运动性、鞭毛形成状况和鞭毛基因表达情况，以及测定所构建的菌株在低温下的生长情况，以探究MogR对Lm低温下鞭毛形成的影响，为阐明Lm低温生长机制提供新的信息。
1材料与方法
1.1菌株、质粒和引物
本研究所涉及的细菌菌株和质粒如表1所示。所用引物均由武汉擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表2所示。
1.2主要试剂
牛脑心浸出液肉汤(brain heart infusion,BHI)培养基购自青岛海博生物技术有限公司；氨苄青霉素(ampicillin,Amp)和红霉素(erythromycin,Erm)购自武汉华大至善生物科技有限公司；高保真DNA聚合酶和反转录试剂盒等购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司；电镜负染液磷钨酸(phosphotungstic acid,PTA)购自中国科学院武汉病毒研究所；用于荧光定量PCR的2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)购自武汉擎科生物科技有限公司。
图1单增李斯特菌鞭毛基因操纵元[6-7]
表1细菌菌株和质粒
1.3缺失株ΔmogR和ΔflaA及其回补株cΔmogR和cΔflaA的构建
以ATCC 19115为模板，用引物mogR(L)-F/R和mogR(R)-F/R(表2)扩增mogR上下游同源臂(图2)。Overlap PCR连接上下游同源臂，将同源臂融合产物连接到自杀型温敏穿梭质粒pHT304-ts中，获得含有mogR上下游同源臂基因的重组质粒p2102N。转化p2102N入大肠杆菌DH5α后，由武汉天一辉远生物科技有限公司对p2102N中的同源臂序列进行测序，测序结果符合预期。提取p2102N，电转化(2.4 kV)于ATCC 19115感受态细胞，鉴定获得阳性转化子后，利用同源重组原理筛选，获得缺失株ΔmogR(图2)。除用引物flaA(L)-F/R和flaA(R)-F/R(表2)扩增flaA上下游同源臂外，缺失株ΔflaA的构建方法同ΔmogR。用引物mogR-F/R(表2)扩增包括自身启动子的mogR，连接于穿梭载体pHT304，获得重组质粒p2201，对p2201中的目的基因片段进行测序，提取测序正确的重组质粒电转化入缺失株ΔmogR感受态细胞中，PCR鉴定，获得回补株cΔmogR。除用引物flaA-F/R(表2)扩增包括自身启动子的flaA外，回补株cΔflaA的构建方法同cΔmogR。