副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于温热带地区的近海海水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中。该菌是一种人畜共患菌，它能引起水产动物疾病的发生，给水产养殖业带来巨大损失[1]，同时也是人类食源性疾病重要病原之一。副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在世界各地区频繁发生，以沿海城市为主[2]。它是亚洲许多国家引起食源性肠胃炎的主要病原菌[3]。我国食源性疾病监测资料显示[4-5]，副溶血性弧菌食物中毒居细菌性食源性致病之首。抗生素通常被认为是治疗此类疾病的良好药剂，但随着抗生素的大量使用该菌的耐药性不断增加。
1996年，美国食品及药品管理局(FDA)，疾病预防和控制中心(CDC)和美国农业部(USDA)建立了国家耐抗菌素监测系统(NARMS)。表明微生物耐药性是一个日趋严重的问题。世界卫生组织(WHO)在2011年4月7日的世界健康日中强调微生物耐药性的重要性[7]，呼吁积极采取措施应对微生物耐药性。我国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，耐药菌引起的医院感染人数已占住院感染总人数的30%左右。然而，各相关部门对食源性病原微生物抗菌药耐药风险评估研究工作基本上没有开展[8]。
因此，本研究的主要目的是，通过不同温度下不同耐药性致病副溶血性弧菌生长特性的比较，为食品安全风险评估提供数据支持。同时，对这些菌株进行ERIC-PCR分子分型，从基因型角度分析其变异性，另外，一级生长模型的建立，为以后的耐药性副溶血性弧菌的风险管理提供依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
胰蛋白胨大豆肉汤，TCBS培养基，Luria-Bertani营养肉汤，Luria-Bertani营养琼脂均购于北京陆桥技术有限责任公司;Mueller Hinton Agar(MHA)英国OXOID。
抗生素:阿莫西林-克拉维酸(Amoxicillin-clavulanic acid)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢他啶(Ceftazidime)阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、四环素(Tetracycline)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、氯霉素(Chloramphenicol)，复方新诺明(Trimethoprim-Sulfamethoxazole)均由英国OXOID公司生产。
MLS-3750型高压灭菌锅三洋电机生物医药株式会社;SW-CJ-1FD系列超净工作台上海新苗医疗器械制造有限公司;GHP-9270型隔水式恒温培养箱上海一恒科技有限公司;Bioscreen FP-1100C型全自动微生物生长曲线分析仪芬兰，Oy Growth Curves Ab Ltd公司。
1.2菌株的获得
菌种:实验用的副溶血性弧菌菌株经过PCR检测其致病基因tdh，trh(方法参照GB/T4789.7-2008，FDA 2004 Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 9)。获得的8株含有tdh基因的菌株用25%的甘油管保存，一份置于-20℃冰箱保存待用，一份置于-80℃冰箱保存。
1.3药敏实验
菌株活化:将副溶血性弧菌菌株从-20℃保存的甘油管中经活化后划线至TCBS平板，37℃培养18～24h。从TCBS平板上挑取绿色的单菌落接种至10mL TSB(3%NaCl，pH8.0)中，放入摇床中，37℃，150r/min，培养18h，同时，三株质控菌EscherichiacoliATCC25922、StaphylococcusaureusATCC25923和PseudomonasaeruginosaATCC27853经活化后划线至LBA平板，37℃培养，挑去单菌落至LB中摇床培养18h。
药敏实验:按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)规定[9]，K-B纸片扩散法对分离的副溶血性弧菌菌株耐药性进行测定。首先将菌液调至浊度为1.5×108cfu/mL(OD值约为0.13)，用棉拭子蘸取一定量的菌液均匀涂布到约4mm厚度的MHA平板上，待干后，将带有特定浓度的药敏纸片贴于平板上。置于37℃恒温培养箱中培养18h测量抑菌圈的直径。副溶血性弧菌的敏感性判定标准见表2。
1.4生长参数的获得
1.4.1生长曲线测定将副溶血性弧菌菌株从-20℃保存的甘油管中活化后，划线至TCBS平板，37℃培养18～24h。从TCBS平板上挑取绿色的单菌落接种至10mL TSB(3%NaCl，pH8.0)中，放入摇床中，37℃，150r/min，培养18h，菌株生长到达指数后期(109CFU/mL)，以此为初始接种液。
采样梯度稀释法:在Bioscreen配套的100微孔板中进行梯度稀释。吸取初始接种液20μL接种至第一孔180μL TSB中，以此为第一稀释梯度。用移液器吹吸混匀后，再从这个孔中吸取20μL接种至第二孔180mL TSB中，依次梯度稀释到第5孔(104CFU/mL)TSB中，按相同方式做两个平行，将加好菌液的100孔板放入Bioscreen的样品槽中，Bioscreen的设置为每30min读取一次，中速震荡，吸光度为420～580nm的宽波段，培养温度分别为20，25，37℃，分别测定这三个温度下的生长曲线，每组实验重复两次。
生长曲线拟合分析采用OriginPro 8软件，生长参数数据比较采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。
表1药敏纸片的中英文名称及剂量
表2 8株菌株的耐药结果
注:R表示耐药;S表示敏感;I表示中介。
1.4.2应用微生物预测模型采用修正的Gomperz growth model(1)[10]，用OriginPro8软件拟合方程如下
y=α0+(α-α0)×exp(-exp(1+μmax×2.72×((λ-t)/(α-α0))))(1)
初始OD值为α0=0.12为104菌量时的OD值。α代表最大的生长的OD值，λ代表延滞期(h)，μmax表示最大比生长速率(h-1)
1.5 ERIC-PCR比较菌株的差异性
ERIC-PCR扩增引物[11]Eric1:5′-TAAGCTCC TGGGATTCAC-3′、Eric2:5′-AAGTAAGTGACTGGGG TGAGCG-3′，由上海生物工程有限公司合成;PCR体系为:12.5μL的TaKaRa公司的Mix，引物(10μmol/L)各1μL、200ng DNA模板，用经灭菌的去双蒸水补齐25μL。ERIC-PCR扩增条件:预变性95℃7min、变性94℃1min、退火52℃1min、延伸65℃8min、总延伸65℃16min、10℃保存、30个循环。使用1.5%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，缓冲液为1×TAE，以120V恒压电泳，电泳约60min后使用溴化乙锭染色15min后进行成像观察并保存。
ERIC-PCR图谱分析以分子量大小相同的条带作为相同性状，阳性结果记为1，阴性结果记为0，使用Gel-pro 4.5软件分析，将输出的结果以Dice为系数采用非加权平均法(UPGMA)利用SLT-Ntsy-2.10e软件进行聚类分析。
不同耐药性致病副溶血性弧菌在20℃、25℃、37℃下的生长曲线（一）
不同耐药性致病副溶血性弧菌在20℃、25℃、37℃下的生长曲线（二）