恶性肿瘤体外细胞系的培养和建立，为恶性肿瘤的基础和临床研究提供了非常重要的实验手段和实验材料，在恶性肿瘤发病机理及新的治疗措施探讨中起着重要作用。卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，其病死率高居各类妇科肿瘤的首位，体外建立卵巢癌细胞系及实验模型，有着重要的意义。本研究自2007年12月从人复发性卵巢癌获取原代培养细胞以来，历时18个多月，传代80余代，在体外成功建立起人卵巢癌细胞系，命名为OV1228，现将其建立过程及生物学特性报告如下。
1材料与方法
1.1主要试剂
RPMI 1640培养基，10%胎牛血清,青霉素100 U/mL，链霉素100μg/mL，0.125%胰酶，0.05%四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，0.1%Triton X-100，Tris HCl(pH 7.4)，0.55 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl等。
1.2人卵巢癌细胞株OV1228的建立
1.2.1一般资料患者，女性，59岁，于2007年12月28日行卵巢癌肿瘤细胞减灭术。部分卵巢肿瘤标本经10%福尔马林溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，HE染色。由病理专业人员在光学显微镜下阅片，癌变状况如图1所示，癌组织位于表面，多层排列，癌细胞核大、深染，有明显的异型性。
图1人卵巢癌OV1228细胞原组织来源病理切片(×200)
1.2.2肿瘤标本及处理取部分无坏死的新鲜肿瘤组织标本在层流超净台上，用Hank′s液洗涤2次后，剪成1 mm3大小组织，于200目金属网筛上用注射器针栓轻轻研磨，用含青、链霉素的培养液RPMI 1640冲洗、过筛，制成单细胞悬液，经单克隆化生长后调细胞浓度为5×104/mL，进行细胞培养和传代，取不同代数的细胞冻存于-196℃液氮中保种，同时进行细胞生物学特性分析。
1.3细胞形态学观察
相差显微镜下观察体外培养细胞的生长状态，并进行摄影；另接种细胞于100 mL培养瓶内，当细胞长满培养瓶后用胰酶-EDTA液消化分散细胞，收集于10 mL管内离心成细胞小团，经2.5%戊二醛锇酸双固定，Epon 812包埋，超薄切片、染色，在H-600型电镜下观察。
1.4细胞生长曲线测定
以2.5×104/mL接种在24孔细胞培养板中，置37℃、5%CO2温箱中培养24 h，从次日起，每天计数3孔细胞，取均值，连续7 d，绘制细胞生长增殖曲线，根据Patterson公式，计算细胞在对数生长期的倍增时间。
1.5软琼脂集落形成率
将1.25%的琼脂煮沸溶解，稀释成0.5%的琼脂，加于60 mm平皿内，凝固后将含单细胞的0.33%的琼脂液接种于底层琼脂上，接种密度为5.0×104个细胞/皿，置37℃，5%CO2温箱内培养，15 d后计数含30个细胞以上的集落，按公式计算出集落形成率：集落形成率=(集落数/接种细胞数)×100%。
1.6核型分析
细胞传代后培养2 d，加入秋水仙素(1 ng/mL)继续培养2 h后收获细胞，按常规方法制备染色体进行核型分析。
1.7裸鼠接种
裸鼠购自北京动物所，接种细胞时鼠龄为6周，培养细胞经胰酶消化，用无血清培养基制成单细胞悬液接种于6只裸鼠右腋部皮下，每只裸鼠注射0.3 mL(1.0×107个细胞)，无菌条件下喂养，每周检查3～4次，4周左右，当瘤体总直径达1 cm以上时照相后处死，取出肿块作病理切片检查。
2结果
2.1细胞形态学观察
倒置显微镜下可见卵巢癌细胞边缘清晰,形态以多角形、梭形或圆形卵石状排列，见图2A。透射电镜显示：瘤细胞呈簇或散在分布，细胞无明显坏死和凋亡，细胞卵圆形或多边形，胞质丰富，表面有少量短的细胞突起，部分细胞间可见发育比较差的桥粒样结构，胞质电子密度低，胞质内细胞器稀少，可见少量线粒体和内质网，散在分布少量糖原颗粒，具有明显的恶性卵巢癌细胞特征，见图2B。
图2光学和电子显微镜观察OV1228细胞形态A：倒置显微镜显示的卵巢癌原代细胞(×40)；B：电镜显示OV1228细胞表面有少量短的细胞突起，具有明显的恶性卵巢癌细胞特征(bar=1μm)
2.2 OV1228细胞群体倍增时间的测定
根据每天记录的细胞平均数，在座标纸上绘出细胞生长曲线，可见细胞在7～8 d达到峰值，细胞群体倍增时间为29.39 h(图3)。
图3 OV1228细胞生长曲线
2.3细胞集落形成率
细胞在软琼脂中培养15 d后，在倒置显微镜下计算>30个细胞的集落，根据公式计算出的集落形成率为17.5%。
2.4核型分析
对第50代细胞进行常规染色体分析，细胞核型为多倍体，染色体数目波动在21～61条之间，多为亚二倍体，少数超三倍体。分析发现染色体、染色单体断片，环状染色体、双微体、三射体等染色体畸变，畸变率为21.95%，见图4。
图4 OV1228细胞的核型分析(×1 000倍，Giemsa染色)
2.5异体致瘤性
卵巢癌细胞接种于裸鼠腋部皮下后，于第3周在接种部位出现肿瘤生长，见图5。第4周取出肿块，其肿块直径在1.2～1.8 cm之间，肿块病理组织学检查表明其卵巢癌细胞形态与原实体瘤相似。
图5 OV1228移植裸鼠腋部皮下后长出肿块
3讨论
恶性肿瘤的发生、发展是一个十分复杂的过程，受各种生物因素的影响。在体内直接研究癌细胞的生物学特性有较大的难度，受到很多因素的制约，而在体外建立永生化的癌细胞系可免受机体内各种因素的干扰，便于探讨各种物理、化学、生物等因素对癌细胞生命活动的影响，特别是在抗癌药物的筛选及肿瘤免疫治疗与基因治疗方面具有独特的优势。因此，建立人癌细胞系是研究人类肿瘤必不可少的重要手段。
癌细胞体外建系是一个漫长而复杂的过程，特别是用原发肿瘤组织直接体外培养建系被认为成功率极低。但我们在研究文献的基础上，从19例培养标本中成功应用原代肿瘤细胞培养并通过克隆稀释法建立起人卵巢癌肿瘤细胞株OV1228，这些癌细胞在体外传25代后，生长速度明显加快，并具有无限增殖能力。肿瘤生物学特性研究发现肿瘤细胞中染色体数目和结构异常，细胞的形态学和超微结构都具有腺上皮细胞癌结构的特性，但细胞分化较差，具有高度异体致瘤性等恶性特征。以上特征说明，我们已成功建立起新的人卵巢癌细胞株。OV1228卵巢癌细胞系的建立，丰富了人卵巢癌细胞系的类型，为进一步研究卵巢癌的生物学特征提供了合适的体外模型。