由于化石燃料消耗导致的气候变化和环境恶化的挑战，需要使用木质纤维素生物质作为原料高效生产第二代生物燃料。然而木质纤维素水解产物中存在的抑制剂会导致生长抑制和发酵效率受损。抑制剂主要包括乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛(5-HMF)等。酵母细胞絮凝是一种无性、可逆、钙依赖性细胞聚集，广泛用于经济有效地从发酵培养基中分离生物质。自絮凝酵母菌株SPSC01已用于工业连续乙醇发酵。絮凝赋予酵母细胞提高对乙醇和乙酸胁迫的耐受性。研究表明，操纵多个基因，如RTC1、ACS1、RCK1、PMA1、CCW12和ADY2，可以赋予酵母细胞更高的乙酸抗性。通过操纵蛋白激酶来提高酵母稳健性的研究仍然有限。膜磷酸蛋白质组分析已用于研究酿酒酵母对乙酸胁迫（在pH 4.0下暴露于50 mM乙酸1小时）的早期反应，并确定调节各种转运蛋白的蛋白激酶Hrk1参与乙酸胁迫酸应激反应。然而到目前为止，还没有关于多组学数据的综合分析来研究对乙酸胁迫的适应性反应和培育强健酵母菌株的报道。膜磷酸蛋白质组分析已用于研究酿酒酵母对乙酸胁迫（在pH 4.0下暴露于50 mM乙酸1小时）的早期反应，并确定调节各种转运蛋白的蛋白激酶Hrk1参与乙酸胁迫酸应激反应。然而到目前为止，还没有关于多组学数据的综合分析来研究对乙酸胁迫的适应性反应和培育强健酵母菌株的报道。研究人员通过比较乙酸胁迫下的絮凝和非絮凝菌株，进行转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组，以探索关键的应激反应蛋白。确定了几种关键的蛋白激酶，可以通过操纵它们来提高酵母的应激耐受性并增强纤维素乙醇的发酵。这项工作的结果为使用工业酵母高效生产纤维素乙醇提供了基础。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
首先将菌株培养过夜并转移至新鲜的YPD培养基中。当种子生长到指数生长期时，通过3,000转速离心3分钟收集细胞，用无菌蒸馏水洗涤，并接种到微量滴定板中初始OD600为0.1的发酵培养基中。在Bioscreen C中，每0.5小时测量并记录酵母菌株的细胞生长(OD600)。菌株的培养条件控制在30℃、中速振荡。对于压力耐受性测试，4 g/L糠醛或10 mM H2O2将添加到培养基中。工程酵母菌株的生长在摇瓶中通过Bioscreen C（Bioscreen，芬兰）进行评估。
实验结果
多组学数据的综合分析揭示了乙酸胁迫下酵母细胞絮凝导致多种蛋白激酶表达及其蛋白磷酸化状态的变化。蛋白激酶Hog1和解毒酶基因GPX1的过度表达提高了应激耐受性。随后，与Hog1相互作用的关键蛋白激酶基因的过度表达增强了使用玉米芯水解物的乙酸耐受性和发酵性能。特别是通过过表达蛋白激酶基因AKL1，比生长率提高了40.0%，乙醇生产率提高了92.9%。这些结果提供了通过操纵关键蛋白激酶来提高纤维素乙醇产量的替代策略。
图1、通过酵母细胞絮凝提高醋酸耐受性。A，絮凝菌株SPSC01和非絮凝菌株PLY01（SPSC01-ΔFLO1）的观察。上图，摇瓶培养物的照片；下图：光学显微镜下的图像。B，两个菌株在5.0 g/L乙酸存在下的乙醇发酵。
图2、提高的抗氧化能力赋予细胞对乙酸更高的抵抗力。A，乙醇发酵过程中在有或没有5.0 g/L乙酸胁迫的情况下SPSC01和PLY01中ROS的积累。B，5.0 g/L乙酸胁迫下SPSC01和PLY01的GPX活性。C和D，PLY01和PLY01-GPX1在5.0g/L乙酸胁迫下的生长和乙醇发酵性能。
图3、Hog1是对乙酸反应的关键调节因子。A）通过比较SPSC01及其非絮凝突变体PLY01获得的磷酸化蛋白质组学数据中的富集磷酸化残基基序，通过MOMO检测到。B和C，亲本菌株PLY01、HOG1过表达菌株PLY01-HOG1和HOG1缺失菌株PLY01-ΔHOG1在5.0 g/L乙酸胁迫下的生长和发酵性能。在PLY01和PLY01-HOG1中测试了D和E、ROS积累和GPX活性。
图4、多种蛋白激酶与Hog1相互作用并导致醋酸耐受性。A和B）在5.0 g/L乙酸存在下，使用过表达六种选定蛋白激酶基因的重组酵母菌株和对照菌株PLY01的细胞生长和乙醇发酵性能。C）通过酵母双杂交系统验证了Hog1在体内与选定的蛋白激酶相互作用。PC，阳性对照。NC，阴性对照。AD、GAL4激活域。BD、GAL4 DNA结合域。AD和BD分别与Hog1或靶蛋白激酶融合。
图5、关键蛋白激酶和抗氧化应激相关基因的过度表达可改善纤维素乙醇发酵。A和B，基因过表达菌株在含有模拟玉米秸秆水解产物抑制剂混合物的发酵培养基中的生长和乙醇发酵。C和D，使用玉米芯水解产物的PLY01、PLY01-HOG1和PLY01-AKL1的生长和乙醇发酵。
总结
细胞自絮凝赋予酵母菌株改善的环境胁迫耐受性，有利于生物生产。探索絮凝细胞和非絮凝细胞之间代谢和调控网络的差异，有利于开发具有令人满意的发酵效率的菌株。在这项工作中，研究人员使用絮凝酵母酿酒酵母对转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组进行了综合分析SPSC01及其非絮凝突变体在乙酸胁迫下生长，结果揭示了蛋白激酶的显着变化。通过絮凝上调的丝裂原激活蛋白激酶Hog1的过度表达导致ROS积累减少和谷胱甘肽过氧化物酶活性增加，从而导致压力下乙醇产量的提高。在测试的七个编码蛋白激酶的基因中，AKL1在过表达时表现出最佳性能，在玉米芯水解产物和模拟玉米秸秆水解产物中实现了更高的乙醇生产率。这些结果为通过改造酿酒酵母中的关键蛋白激酶来提高纤维素乙醇的生产提供了替代策略。
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