吉林省是我国玉米生产大省，玉米深加工技术在延长产业链、优化产业结构、增加产品附加值方面发挥着重要作用，是解决三农问题的一个重要措施。玉米淀粉的生产是玉米深加工的一个重要方面，其生产过程中所产生的玉米黄浆也含有多种可溶性蛋白、生长素和一些前体物质。本课题组筛得一株能够在以玉米淀粉、玉米黄浆为碳、氮源的培养基上繁殖并产β-1,3葡聚糖酶和多糖的罗耳阿太菌(AtheliarolfsiiAY6657741)。
罗耳阿太菌多糖(Atheliarolfsiiexopolysaccharides)是由罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)发酵产生的一种胞外多糖，多糖的主链由D-吡喃葡萄糖以β-1,3糖苷键连接而成，因其具有免疫调节、降低胆固醇、降血糖等生理活性，受到了科研工作者的广泛关注。β-1,3葡聚糖酶广泛存在于动物、植物、微生物中，能够特异性地作用于以β-1,3糖苷键连接的多糖聚合体，这一特性赋予该酶水解真菌细胞壁的能力，使它不但在啤酒生产、果酒酿造以及食品保鲜等行业中具有重要应用，而且在粮食作物病虫害防治领域发挥重要作用。
为获得罗耳阿太菌β-1，3葡聚糖酶和胞外多糖同时高产的发酵条件，以玉米淀粉和玉米黄浆作为发酵培养基的重要组分，以罗耳阿太菌β-1,3葡聚糖酶产量和胞外多糖产量为指标，选择培养温度、培养时间、摇床转速为优化因素，在单因素试验的基础上，通过响应面试验进行双响应值优化，对所得结果的三维图和等高线叠加图进行分析，获得了双指标同时达到最优的发酵条件。结果表明：接种量5%、培养温度28.5℃、培养时间7.5 d、摇床转速180 r/min时，粗酶产量39.96 U/mL，多糖产量18.11 g/L，分别达到了预测值的98.96%和99.27%。
原料
罗耳阿太菌(AtheliarolfsiiAY6657741)由吉林农业大学发酵工程实验室分离纯化并石蜡封存。
玉米淀粉：市售；玉米黄浆：黄龙食品有限公司，pH 4.16，蛋白含量4.2 g/L。
试验试剂
PDA培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15～20，自然pH。罗耳阿太菌发酵培养基(g/L)：玉米黄浆5%(V/V)，玉米淀粉30，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，NaNO33.0，柠檬酸0.5，pH为4.5。SDS-PAGE试剂盒。Tris-Gly电极缓冲液(g/L)：Tris 14.4，甘氨酸3(变性另加SDS 1)。考马斯亮蓝染色液：50%(V/V)甲醇，0.2%(m/V)考马斯亮蓝R-250，10%(V/V)乙酸，40%(V/V)H2O。考马斯亮蓝脱色液：20%(V/V)甲醇，20%(V/V)乙酸，60%(V/V)H2O。孵育液：100 mL醋酸钾(50 mmol/L，pH 5.5)溶液中含0.1 g昆布多糖。显色液：200 mL NaOH(1.0 mol/L)中含0.3 g 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)。DNS：称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1 000 mL容量瓶，加入325 mL 2 mol/L NaOH溶液，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1 000 mL。海带多糖、罗耳阿太菌多糖及透析袋(截留相对分子质量为6 000～8 000)；其他试剂均为国产分析纯。
发酵培养的单因素试验结果
发酵培养罗耳阿太菌生产多糖和酶的单因素试验结果如图1所示。
由图1a可知，随着培养温度的升高，多糖和酶产量都有所提高，当温度达到30℃时，二者产量几乎同时达到最大值。随着温度继续上升，二者产量反而下降，这可能是由于温度过高不利于罗耳阿太菌的生长，影响了酶和多糖的合成。
由图1b可知，在发酵7 d时，多糖的产量最高，继续延长发酵时间，多糖产量下降，这可能是由于在发酵中后期，培养液中的碳源几乎耗尽，由β-1,3葡聚糖酶作用的可逆反应开始向逆反应方向进行，酶催化多糖的水解致使多糖产量下降。也正是如此，这一作用开始促进微生物对酶的积累，在发酵进行的第8天，酶的产量达到一个高峰，但后期营养物质缺乏，菌体生长进入衰亡期，使代谢产物酶的产量急剧下降。
由图1c可知，在摇床转速为175 r/min时，多糖和酶产量均达到峰值。这是由于适当的振荡会增加菌体与发酵液中营养物质的接触面积，有助于菌株的生长，因此随着摇床转速的提高，2个指标都呈现上升的趋势，当转速高于175 r/min后，继续提高转速反而会导致指标产量下降，这可能是由于过高的转速导致剪切力变大，从而影响多糖和酶稳定结构的形成，致使二者产量下降。
图1培养温度、培养时间、摇床转速、装液量对粗酶和多糖产量的影响
由图1d可知，装液量不同时，2个指标的产量虽有轻微波动，但都趋于平稳，这可能是由于溶氧率对该菌种的生长无显著影响，因此，不选择装液量作为响应面的分析因素。
响应面法双指标优化最佳发酵工艺条件
Box-Behnken试验设计与结果分析
根据单因素试验结果，选择培养温度、培养时间、摇床转速作为Box-Behnken中心组合试验设计的3个因素开展试验，双指标优化最佳发酵条件的响应面试验设计及结果见表1。
表1 Box-Behnken试验设计及结果
双指标响应值所得回归模型函数表达式：
粗酶产量=-305.22+7.96X1+27.01X2+1.45X3+0.24X1X2-7.10E-003X1X3-0.04X2X3-0.15X12-1.76X22-2.64E-003X32(R2=0.982 7)
多糖产量=-58.45+1.48X1+10.72X2+0.18X3-0.02X1X2+2.8E-004X1X3-1.4E-003X2X3-0.02X12-0.67X22-4.92E-004X32(R2=0.987 2)
以上2个方程的R2值都接近于1，说明通过二次回归得到的多糖及粗酶产量的模型与试验拟合较好，可靠性高。
结论
利用玉米淀粉和玉米黄浆为培养基，成功培养出产罗耳阿太菌胞外多糖和β-1,3葡聚糖酶的罗耳阿太菌，最优发酵条件为：培养温度28.5℃，培养时间7.5 d，摇床转速180 r/min，多糖产量18.11 g/L，粗酶产量9.96 U/mL。
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