芳香族氧苯氧丙酸酯(AOPPs)是选择性的出苗后除草剂,用于控制含有均质乙酰辅酶A羧化酶的一年生和多年生禾本科杂草(野燕麦、稗草、绿鬃草、普通海棠草、野小米和鹅草),对含有异质乙酰辅酶A羧化酶的阔叶杂草和双子叶植物没有活性。AOPPs是一种内部吸收的传导性除草剂,从叶片表面吸收,通过木质部和韧皮部转运到整个植物中,并在分生组织中积累,抑制脂肪酸的生物合成,导致杂草坏死。2014年,AOPP的全球销售额达到121.7亿美元,占全球除草剂市场的4.6%。


Quizalofop-p-ethyl(QPE)是一种单一R构型AOPP[5],由日产化学工业公司于1984年开发,被宣布为除草剂商业制剂中的活性成分。预计QPE将在未来几年迅速增加,以克服草甘膦抗性杂草的广泛出现。由于性能优异,QPE被用于马铃薯、大豆、甜菜、花生、油菜、向日葵、蔬菜、棉花、亚麻等阔叶植物等作物。


QPE的广泛应用在以下几个方面导致了有害影响:混合胆汁淤积/肝细胞肝损伤;脂肪酸降解途径中基因表达的改变;对雄性大鼠的生殖毒性;内分泌紊乱和急性毒性;对泥鳅和大鳞副泥鳅的遗传毒性;对斜生四链藻和小柠檬的植物毒性;对哈茨木霉等土壤微生物的微生物毒性;QPE及其主要代谢物QPE(QP)可以被对映选择性降解,QP(LC50:26.69μg cm−2)对赤子爱胜蚓的毒性远远高于QPE(LC50:209.2μg cm−2)。根据世界卫生组织(WHO)对药物不良反应的定义(2000年)和美国环境保护署(EPA)的III类毒性(2011),QPE是一种有毒化学物质,已被欧盟禁止。一些国家对其使用设置了限制:加拿大的QPE在蔬菜上的最大残留量限制为0.06 mg/L,但QPE在中国可以不受限制地自由使用。过度使用的QPE甚至是一种原水污染物,因此消除QPE的残留对环境修复至关重要。


由于其环保的特性,利用微生物工艺修复污染场所已被证明是有效和可靠的。因此,近年来已经分离出一系列对不同AOPPs具有降解能力的微生物。从Pseudomonas,Aquamicrobium,Acinetobacter,Ochrobactrum,及Rhodococcus中鉴定出一些酯酶可以在细胞外降解QPE。其中大部分属于V、VII、VIII家族,氨基酸序列的相似性差异很大。然而,对细菌降解特性的研究还不足以用于实际的生物修复。QPE的降解只停留在前期阶段,即QPE向QPE的主要代谢物QP的转化。到目前为止,还没有研究报道过单个菌株降解QP的情况。其降解机制尚不清楚。因此,迫切需要QPE优越的降解细菌资源和完整的矿化途径。


化学品和试剂


QPE标准(纯度98.7%)、环氟丁基(纯度96.5%)、丙炔基(纯度98.2%)、非诺沙对乙基(纯度99.2%)、氟氧甲基(纯度98.2%)、氟丁基(纯度94.8%)、二氟甲基(纯度99.6%)、氟(97.9%)、氟(9%纯度99%)、纯度(纯度94.1%)购自沈阳化工研究院有限公司。喹啉(QP,>纯度95%)、(4-(6-氯喹啉-2-环氧基)苯酚(CYP,纯度95%)和喹啉(纯度95%)购自Sigma。所有标准物质的原液(1×104 mg/L)均用甲醇溶解(HPLC级)制备。


培养基


矿物盐培养基(MSM):1.5 gNH4NO3,0.5 gKH2PO4·12H2O,1.5 gK2HPO4,0.2 gMgSO4·7H2O,0.5 gNaCl,和1‰(v/v)微量元素溶液(TES)。TES:FeSO4·7H2O(2.0 g/L),ZnSO4(0.1 g/L),CuSO4·5H2O(0.03 g/L),MnCl·4H2O(0.03 g/L),CoCl·7H2O(0.3 g/L),Na2MoO4·2H2O(0.03 g/L)和Na2WO4·2H2O(0.02 g/L)。NaCl溶液(200 mg/mL):20 gNaCland100 mLMSM.Luria-Bertani(LB)培养基:10 g/Lpeptone,5 g/L酵母粉和10 g/LNaCl。用氢氧化钠或盐酸(2mol/L)将所有培养基的pH值调整为7.0±0.2。所有培养基在121℃下高压灭菌20min。每升加入16g琼脂制备MSM和LB的固体培养基。


生长和降解实验


将分离株YC-XJ1在含有50 mg/L QPE和5‰甲醇的100 mL MSM培养基中生长约28 h,离心(5000 rpm,10分钟),然后用新鲜MSM洗涤3次,调节至约OD600=1.0.将细菌悬浮液接种(1%,v/v)接种到含有50 mg/L QPE和5‰甲醇的10 mL MSM中(即补充有50μL QPE储备溶液),并在30°C和180 rpm下孵育。每隔12 h孵育一次,用紫外可见分光光度计(Thermo Scientific,Massachusetts,USA)监测细菌生长,并通过HPLC测定QPE的残留浓度。每次处理分三次重复进行,并将未接种的样品设置为对照。


细菌富集及其降解QPE的能力


在本研究中,QPE(50 mg/L)在5 d内被连续富集产生的细菌培养物完全降解。从固体MSM板中分离纯化出一种好氧粉红色QPE降解细菌,该菌株被命名为YC-XJ1。图1a显示了QPE的降解和菌株YC-XJ1的生长。在pH 7.0和30°C条件下,约97%的QPE(50 mg/L)可在96 h内降解。QPE的降解速率与菌株YC-XJ1的生长曲线呈正相关。YC-XJ1在MSM平板上的菌落形态为粉红色、光滑、圆形、突出。菌株YC-XJ1是革兰氏阴性杆状细菌,其两端在显微镜下染色较深。TEM照片显示,如Fournier等所述,图1b中,杆状细菌大小为2-8μm×0.5-2μm,两端凸弯曲结构,鞭毛长而薄且空心。


BIOLOG Gen III微孔板属种鉴定结果为M.extorquens,SIM值0.682,>0.5,DIST值4.533,<5,在置信区间内。


生理生化特性表明,菌株YC-XJ1具有利福霉素耐药性,对萘啶酸、碲酸钾和四唑紫敏感。在碳源检测实验中,仅在甲酸、α-酮戊二酸和L-苹果酸中发现了阳性结果(图S2)。YC-XJ1不能利用任何糖类的结果可能是LB中不生长的原因。


利用BLAST软件对16S rRNA基因序列(1446 bp)进行比对,与M.populi BJ001的同源性为99.7%,与M.extorquens的同源性为99.5%,与M.thiocyanatum的同源性为99.3%。构建了包含23株甲基杆菌类型的系统发育树。最大似然分析结果显示(图1c),菌株YC-XJ1的最近亲缘关系分别为M.populi和M.thiocyanatum。


YC-XJ1的基因组序列与M.populi基因组的平均核苷酸同源性性为97.9%,基因组覆盖率为88.6%。因此,菌株YC-XJ1最终被鉴定为M.populi。

图1.菌株YC-XJ1的形态学和系统发育树分析。(a)菌株YC-XJ1的生长曲线和50 mg/L QPE的降解曲线。(b)透射电子显微镜下菌株YC-XJ1的。(c)基于16S rDNA序列分析的菌株YC-XJ1系统发育树。使用Kimura双参数G+I参数模型和1000次重复的bootstrap分析构建最大似然树。


相关新闻推荐

1、滑液支原体与猪鼻支原体生长曲线绘制及世代时间确定

2、新型靶向抗癌药HDAC抑制剂可诱导肿瘤细胞分化、选择性凋亡——材料与方法

3、微生物培养基中的生长因子和碳源氮源无机盐生长因子指哪些

4、一种新型复合碘消毒液的研制及其相关性能实验研究

5、金黄色葡萄球菌株PVL基因敲除后生长曲线测定