摘要：采集受草铵膦污染的香蕉园土壤，通过富集培养技术获得以草铵膦为唯一碳源生长的微生物C6菌株。结果表明，C6菌株对草铵膦降解率高达69.01%；通过观察C6菌株的形态学特征结合16S rRNA序列分析，初步鉴定C6菌株为戴尔福特菌属（Delftiasp.）；进一步探讨培养基体积、氮源、草铵膦初始浓度、培养基初始pH值、培养温度、菌悬液接种量、Na+浓度和Mg2+浓度等因素对C6菌株生长的影响。结果显示，C6菌株最适宜的培养条件是培养基体积为75 mL、氮源为硫酸铵、草铵膦初始浓度200 mg·L-1、初始pH值8.5、培养温度25℃、接种量15%、Na+浓度20 g·L-1、Mg2+浓度100 mg·L-1。本研究结果为利用微生物对草铵膦污染土壤进行原位生物修复提供理论依据。
草銨膦（Glufosinate ammonium）又称草丁膦，化学名为4-［羟基（甲基）膦酰基］-DL-高丙氨酸，化学式为C5H15N2O4P，是一种广谱型除草剂，具低毒、活性高和环境相容性好等特点。草铵膦通过与植物体中的ATP相结合并占据谷氨酰胺合成酶（glutamine aynthetase，GS）的反应位点，在植物氮代谢过程中阻碍谷氨酸与铵离子合成谷氨酰胺的途径并随之破坏其后的代谢过程。主要剂型为溶液剂（水剂），由于其杀草谱广、发挥活性作用速度较快，广泛应用于果园、马铃薯以及非耕地等田间杂草的治理。
目前因一系列高毒性除草剂（百草枯、草甘膦等）的禁用，以及农用除草剂的市场高需求，草铵膦作为低毒、高活性的广谱除草剂，其生产量和使用量均居世界前列。随着使用量的增加，且具有较强的水溶性，容易污染水源并进一步在食物链中富集，对环境和人体健康产生潜在威胁，有效降低这些威胁成为目前迫切需要解决的问题。微生物降解是农药残留被降解转换的主要途径之一，具有适用范围广泛、代谢方式多样且相较于物理、化学降解更安全、绿色和有效，因此研究和应用的前景十分广阔。现阶段国内外关于草铵膦的研究主要集中在作用机理以及在不同环境中的行为、毒性等方面，而对草铵膦的降解菌株及相关降解菌株的生长特性方面的研究尚少。本研究旨在从受草铵膦污染的香蕉果园土壤中分离、筛选可降解草铵膦的微生物菌株，并对草铵膦降解菌株的生长特性进行研究，以期为草铵膦微生物降解的深入研究和草铵膦降解菌的产业化利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试土壤
福建省漳州市长泰县常年施用草铵膦的香蕉园，拔除土壤表层杂草和其它杂物后取0～15 cm土样，迅速取回，置于4℃冰箱保存。
1.1.2培养基
以草铵膦为唯一碳源的基础盐培养基，每1 L蒸馏水中组分构成为MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.31 g、FeSO4·7H2O 0.018 g、NaNO3 3.0 g。外加草铵膦用于培养和分离草铵膦降解菌株。LB培养基为10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母粉、NaCl 5.0 g。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基为牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、琼脂18.0 g、蒸馏水1 L，pH值7.0～7.2。
1.1.3草铵膦
草铵膦标准品（阿拉丁/G114499-100 mg），购自阿拉丁官网。
1.1.4主要仪器
电子天平（奥豪斯/AR224CN）、超净工作台（苏州安泰/SW-CJ-2FD）、台式高速离心机（上海安亭/TGL-16C）、立式高压蒸汽灭菌器（上海申安/LDZM-80L）、基础型超纯水系统（上海泽拉布/Dura 12FV）、振荡培养箱（上海知楚/ZQZY-75CN）、生化培养箱（宁波赛福/SPX-250）、pH计（上海仪电/PHS-3C）、超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪（安捷伦/1290-6545）、光学显微镜（Ci-L，日本）。
1.2草铵膦降解菌株的富集和分离纯化
降解菌株的分离纯化在参考吴红萍等方法的基础上进行适当改良。取10 g土壤加入含有100 mL基础盐培养基的250 mL锥形瓶中，外加草铵膦50 mg·mL-1，在生化培养箱中以30℃恒温、150 r·min-1的培养条件培养3 d。取10 mL上层悬浮液加入到100 mL基础盐培养基中，相同条件继续培养，重复上述培养操作至草铵膦浓度为300 mg·mL-1，在相同的培养条件下培养3个周期。待培养周期结束后，梯度稀释样液，并吸取100μg稀释液涂布于改良高氏一号培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，分别在30℃和37℃生化培养箱中恒温培养1～7 d。待菌落长出后，进行观察，用接种环在分离较好且菌落形态不同的单一菌落上沾取少量菌体放入液体培养基进行培养，培养结束后进行平板划线，恒温培养结束后放入冰箱保存备用。
1.3高效降解菌株的筛选
菌株接种到液体培养基中制备悬浮菌液，于振荡培养箱中培养3 d后，以10%接菌量接种到100 mL含300 mg·L-1草铵膦基础盐培养基中，再于振荡培养箱中培养1个周期。培养结束后，吸取2 mL于2.5 mL具塞离心管中，置于台式高速离心机中，以10 000 r·min-1离心10 min，通过0.22μm超滤膜过滤上清液1～1.5 mL到样品管中，用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪测定，另设置未添加微生物降解菌株的草铵膦标准品溶液作为对照组，计算菌株的降解率（％）=（C0-Ct）／C0×100％，式中C0为草铵膦初始浓度，Ct为不同菌株降解作用下草铵膦的浓度。
1.4草铵膦降解菌株的形态与分子鉴定
采用平板涂布法将筛选后的草铵膦降解菌株，在生化培养箱中30℃培养12～48 h。参照《常见细菌鉴定手册》等对降解菌株的形态学特征进行观察。
进一步采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACCCTT-3）扩增菌株序列，并送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。将所得基因序列在NBCI数据库进行BLAST同源性比对分析，选取同源性较高的菌株序列，采用MEGA7.0软件的邻接法（Neighbor-Joining method）构建菌株系统发育树。
1.5草铵膦降解菌株的生长因素优化
草铵膦降解菌株生长因子优化采用Liu等方法。将降解菌株接种在50 mL的LB液体培养基（pH值7.0）中，在30℃、150 r·min-1的振荡培养箱中振荡培养18～24 h（OD600=0.30），再按5%（V/V）的量接种于基础盐培养基中，初始pH值为7.0，初始草铵膦浓度为50 mg·L-1、温度为30℃、150 r·min-1振荡培养箱恒温培养，分别进行以下几组处理测定生长量的变化，每种因素设3个重复试验，以接种灭活的菌株为对照组，24 h后取样测定菌株生长量变化。
设培養基体积分别为25、50、75、100、150、200 mL；设氮源分别为硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠；设草铵膦初始浓度分别为10、50、100、200、300、400、500 mg·L-1；用NaOH或HCl调节初始pH值分别至4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0；设培养温度分别为20、25、30、35、40、45℃；设接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%；将菌悬液按5%接种量接入含有草铵膦降解培养基的锥形瓶中，调节初始pH值7.0、7.5，在30℃、150 r·min-1条件下分别加入5、10、20、30、50、100 g·L-1氯化钠培养1 d后测定草铵膦降解率，重复3次，确定最适Na+浓度。同样设置Mg2+浓度分别为50、100、200、300、400 mg·L-1。
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