青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum是一种广泛分布的土传病原细菌，能够侵染50多个科，200多种植物，在全球范围内能够导致重大的经济损失。由该菌引起的青枯病最早于1864年在烟草中报道，它的起源和早期传播仍未确定。青枯雷尔氏菌能够在潮湿的土壤或水体中存活数年，当遭遇易感宿主，青枯雷尔氏菌就会进入植物根部，在根部皮层定殖，然后入侵木质部导管，最终通过导管系统迅速扩展到植物地上部，在宿主体内大量增殖引起导管堵塞与功能紊乱，出现萎焉症状。
hrcN基因作为植物病原菌T3SS结构基因之一，表达产物为ATP酶（ATPase），通过催化ATP的水解为效应蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP产生的能量重塑多种蛋白底物，因此在膜融合、蛋白质修饰和降解等许多生理活动中发挥重要的作用。Pozidis等研究发现Pseudomonas syringas的HrcN是一种定位于外周膜上的ATP酶，能催化蛋白质易位。与其他T3SS相关的ATP酶一样，HrcN与F0/F1-ATPase亚基同源，包含介导ATP结合和水解的Walker框。由于T3SS分子伴侣不能被分泌或转运，必须在效应蛋白分泌前从分子伴侣-效应蛋白复合体中释放出来，这种作用是由T3SS相关的ATP酶（InvC和HrcN）以ATP依赖的方式进行的。这些ATP酶也作为T3SS效应蛋白的去折叠酶发挥作用，使效应蛋白保持未折叠或部分未折叠的构象。最近Gan等研究发现T3SS效应蛋白的分泌和转位依赖于分子伴侣HpaB的C端区域，其C-端区域的缺失极大的减少了从HpaB与T3SS效应蛋白复合物中释放出游离效应蛋白的数量，其中，HrcN以ATP依赖的方式催化该反应。蛋白互作研究显示，HrcN与T3SS底物特异性开关蛋白HpaC以及分子伴侣HpaB相互作用，促进多种效应蛋白的分泌。研究还发现HrcN可与HrcU和HrcV内膜蛋白互作。
前期在扩增出青枯雷尔氏菌hrcN基因序列基础上，比对发现青枯雷尔氏菌hrcN基因与假单胞菌Pseudomonas syringas1448A、黄单胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和细菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性较高，其中与细菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷尔氏菌T3SS基因hrcN为研究对象，利用融合PCR技术和电转化获得青枯雷尔氏菌CBM613菌株的hrcN基因突变株和回补菌株，通过测定致病力、生长曲线、运动性检测和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。
1材料与方法
1.1供试材料
供试菌株与质粒：野生型番茄青枯雷尔氏菌CBM613菌株由西南大学植物保护学院馈赠，为强致病力菌株；TOP10化学感受态细胞购自美国Thermo公司；pMD19-T载体购自日本TAKARA公司；pJQ200SK、pCVD442和pRK415质粒载体本实验室保存。
供试植物：番茄为感病品种中蔬5号，28℃～30℃光照培养箱培养，光周期16L﹕8D，相对湿度90%，种苗培养至5～6片叶时备用。
试剂及仪器：NA（Nutrient Agar）培养基（牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，蒸馏水加至1000 mL，pH为6.8～7.0）、NB（Nutrient Broth）培养基（NA培养基不加琼脂）、LB（Lysogeny Broth）培养基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加入双蒸水定容到1000 mL，pH为7.0）、TSB（Tryptic Soy Broth）培养基（胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加入双蒸水定容到1000 mL，pH为7.2）、Boucher基础液体培养基（KH2PO413.6 g，(NH4)2SO42 g，FeSO4·7H2O 0.5 mg，L-谷氨酸2.9 g，加入双蒸水定容到1000 mL，用KOH调节pH至7.0）、半固体SMM（Supplemental minimal medium）培养基（葡萄糖0.1 g，蛋白胨0.1 g，EDTA-2Na 38 mg，琼脂3.5 g，磷酸盐缓冲液（pH 7.0）10 mL，加入双蒸水定容到1000 mL）、CPG（Casamino acids Peptone Glucose）培养基（酵母粉1 g，葡萄糖10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，加入双蒸水定容到1000 mL，pH为7.0）；细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)购自日本TAKARA公司；TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer购自立陶宛MBI公司；DMSO购自德国Biofroxx公司；其他试剂皆为国产分析纯。5910R高速冷冻离心机，德国eppendorf公司；C1000 PCR仪、核酸电泳仪、Versadoc 1000凝胶成像系统、MicroPulser电穿孔转化仪，美国BIO-RAD公司。
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