青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum是一种广泛分布的土传病原细菌,能够侵染50多个科,200多种植物,在全球范围内能够导致重大的经济损失。由该菌引起的青枯病最早于1864年在烟草中报道,它的起源和早期传播仍未确定。青枯雷尔氏菌能够在潮湿的土壤或水体中存活数年,当遭遇易感宿主,青枯雷尔氏菌就会进入植物根部,在根部皮层定殖,然后入侵木质部导管,最终通过导管系统迅速扩展到植物地上部,在宿主体内大量增殖引起导管堵塞与功能紊乱,出现萎焉症状。


hrcN基因作为植物病原菌T3SS结构基因之一,表达产物为ATP酶(ATPase),通过催化ATP的水解为效应蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP产生的能量重塑多种蛋白底物,因此在膜融合、蛋白质修饰和降解等许多生理活动中发挥重要的作用。Pozidis等研究发现Pseudomonas syringas的HrcN是一种定位于外周膜上的ATP酶,能催化蛋白质易位。与其他T3SS相关的ATP酶一样,HrcN与F0/F1-ATPase亚基同源,包含介导ATP结合和水解的Walker框。由于T3SS分子伴侣不能被分泌或转运,必须在效应蛋白分泌前从分子伴侣-效应蛋白复合体中释放出来,这种作用是由T3SS相关的ATP酶(InvC和HrcN)以ATP依赖的方式进行的。这些ATP酶也作为T3SS效应蛋白的去折叠酶发挥作用,使效应蛋白保持未折叠或部分未折叠的构象。最近Gan等研究发现T3SS效应蛋白的分泌和转位依赖于分子伴侣HpaB的C端区域,其C-端区域的缺失极大的减少了从HpaB与T3SS效应蛋白复合物中释放出游离效应蛋白的数量,其中,HrcN以ATP依赖的方式催化该反应。蛋白互作研究显示,HrcN与T3SS底物特异性开关蛋白HpaC以及分子伴侣HpaB相互作用,促进多种效应蛋白的分泌。研究还发现HrcN可与HrcU和HrcV内膜蛋白互作。


前期在扩增出青枯雷尔氏菌hrcN基因序列基础上,比对发现青枯雷尔氏菌hrcN基因与假单胞菌Pseudomonas syringas1448A、黄单胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和细菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性较高,其中与细菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷尔氏菌T3SS基因hrcN为研究对象,利用融合PCR技术和电转化获得青枯雷尔氏菌CBM613菌株的hrcN基因突变株和回补菌株,通过测定致病力、生长曲线、运动性检测和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。


1材料与方法


1.1供试材料


供试菌株与质粒:野生型番茄青枯雷尔氏菌CBM613菌株由西南大学植物保护学院馈赠,为强致病力菌株;TOP10化学感受态细胞购自美国Thermo公司;pMD19-T载体购自日本TAKARA公司;pJQ200SK、pCVD442和pRK415质粒载体本实验室保存。


供试植物:番茄为感病品种中蔬5号,28℃~30℃光照培养箱培养,光周期16L﹕8D,相对湿度90%,种苗培养至5~6片叶时备用。


试剂及仪器:NA(Nutrient Agar)培养基(牛肉浸膏3 g,酵母浸膏1 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,琼脂20 g,蒸馏水加至1000 mL,pH为6.8~7.0)、NB(Nutrient Broth)培养基(NA培养基不加琼脂)、LB(Lysogeny Broth)培养基(蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,加入双蒸水定容到1000 mL,pH为7.0)、TSB(Tryptic Soy Broth)培养基(胰蛋白胨15 g,大豆蛋白胨5 g,氯化钠5 g,琼脂20 g,加入双蒸水定容到1000 mL,pH为7.2)、Boucher基础液体培养基(KH2PO413.6 g,(NH4)2SO42 g,FeSO4·7H2O 0.5 mg,L-谷氨酸2.9 g,加入双蒸水定容到1000 mL,用KOH调节pH至7.0)、半固体SMM(Supplemental minimal medium)培养基(葡萄糖0.1 g,蛋白胨0.1 g,EDTA-2Na 38 mg,琼脂3.5 g,磷酸盐缓冲液(pH 7.0)10 mL,加入双蒸水定容到1000 mL)、CPG(Casamino acids Peptone Glucose)培养基(酵母粉1 g,葡萄糖10 g,牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,加入双蒸水定容到1000 mL,pH为7.0);细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司;PrimeSTAR Max Premix(2×)购自日本TAKARA公司;TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer购自立陶宛MBI公司;DMSO购自德国Biofroxx公司;其他试剂皆为国产分析纯。5910R高速冷冻离心机,德国eppendorf公司;C1000 PCR仪、核酸电泳仪、Versadoc 1000凝胶成像系统、MicroPulser电穿孔转化仪,美国BIO-RAD公司。



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