摘要采用盆栽试验，研究添加葡萄枝条对葡萄树体生长及真菌结构的影响，评价修剪葡萄枝条循环再利用的可行性。以一年生“阳光玫瑰”葡萄为试材，分别添加不同比例的葡萄枝条，测定植株新梢长、新梢粗、叶面积、根系总体积等的变化，同时利用高通量测序技术研究土壤真菌群落结构的变化。门水平上，担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）为优势类群。添加枝条处理降低了60，120，150 d时链格孢属（Alternaria）、光黑壳属（Preussia）、枝顶孢属（Acremonium）、丝葚霉属（Papulaspora）、新赤壳属（Neocosmospora）、平脐蠕孢属（Bipolaris）、毛壳属（Chaetomium）、无茎真菌属（Acaulium）、枝孢属（Cladosporium）和间座壳属（Diaporthe）的相对丰度。T2处理还降低了整个处理过程中葡萄穗霉属（Stachybotrys）、Acrocalymma、Albifimbria、Gibellulopsis和曲霉属（Aspergillus）等的相对丰度，并提高了60，90，150 d时小脆柄菇属（Psathyrella）的相对丰度。添加适宜比例的葡萄枝条能够提高葡萄新梢长和根系总体积。T2处理后150 d时新梢长是对照的1.2倍。总之，适量添加葡萄枝条优化了土壤真菌群落结构，有利于木质素的降解，并形成对病原真菌抑制作用的土壤，降低葡萄感染病害的风险，T2处理在改善土壤真菌群落结构及促进树体生长方面综合表现最好。
在过去的几十年中，为了提高农作物产量，在耕地上大量使用化肥、开展集约化生产以及增加负载量，这加速了对土壤的开发利用，导致土壤有机质减少，显著改变了土壤微生物群落结构，造成土壤中原有有机碳损耗，与此同时，修剪等形成的废弃植物残体的清理，导致果园土壤返还的碳量较少。从长远来看，这些因素将会导致土壤退化，引起作物产量降低。如果能合理利用这些修剪废弃物产生的有机碳源，将有助于缓解土壤有机碳损失。因此，生产中应该采取适当的农艺措施，优化土壤微生物群落结构，提高土壤有机质含量。
土壤微生物参与土壤养分循环、有机碳的矿化固定，对土壤有机质和土壤团粒结构的形成具有直接作用，其群落结构在维持土壤生态系统功能上具有重要意义，并最终影响植物的生长。植物残体（修剪枝条、秸秆等）还田与土壤微生物之间是相互促进的关系。植物残体作为有机改良剂对土壤微生物群落结构具有一定的重塑作用，能够改变土壤活性有机碳组分，增加微生物生物量，促进土壤微生物活性的提高和养分循环，进而提高土壤的肥力水平。反之，土壤微生物又参与植物残体的降解过程。土壤真菌在碳源转化过程中发挥关键作用，可推动外源有机物的分解和腐殖化过程。
每年葡萄树修剪都会产生大量废弃枝条，这些枝条中含有丰富的有机质以及各种无机养分。然而，这些废弃枝条常常被当作燃料直接燃烧，这样不但会造成养分的浪费，而且燃烧过程中会产生致癌污染物。美国、澳大利亚、新西兰等国家使用葡萄枝条堆肥覆盖葡萄园，可以有效提高果实产量，降低果实含酸量，并提高果实钾元素的含量。研究指出，在葡萄园中使用葡萄修剪废料堆肥可以对土壤肥力、根系生长、产量和葡萄品质产生有益的影响。因此，如何对葡萄等果树废弃枝条进行合理化利用是目前生产中较为关注的问题。
葡萄枝条木质化严重，较难降解。自然界中真菌、细菌和放线菌均是降解木质素的微生物。其中，真菌可通过分泌胞外酶来完成降解，且降解能力最强。真菌介导的木质素降解主要引起侧链氧化、去甲基化/去甲氧基化、芳香环断裂等过程。然而，关于植物残体还田的研究主要集中于秸秆还田，针对葡萄等木质化枝条还田对土壤微生态，尤其是对真菌群落结构影响的研究较少。不同植物残体还田对土壤微生态环境的影响不同，而这些差异被认为是由植物组织、碎屑数量和质量差异引起的。同样得出，植物材料差异会影响土壤中碳源和养分循环的结论。添加的碳源从降解功能上对土壤微生物群落结构作出改变。因此，有必要对添加葡萄枝条后葡萄根域土壤微生物群落结构变化特征进行研究。
本试验以一年生盆栽“阳光玫瑰”葡萄为试材，设计添加不同比例葡萄枝条处理，研究添加葡萄枝条对葡萄新梢生长、根系发育及土壤真菌群落结构等的影响，以期确定合适的葡萄枝条添加剂量。这既能为葡萄废弃枝条处理提供一种可供选择的方案，又能为葡萄枝条还田后土壤微生态变化提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与处理
试验于2019年3月至8月在天津农科院现代农业科技创新基地（北纬39°43'，东经116°96'）日光温室完成。采用上海余昌园林工程有限公司生产的新60型银杏牌枝条粉碎机（38.5 kW/380 V，700 mm×1 400 mm×1 300 mm）对一年生健康葡萄枝条进行粉碎。枝条粉碎后长为0.5~1.0 cm。为保证定植用栽培园土能够真实准确反映阳光玫瑰葡萄根域土壤微生物代谢特征，这部分土壤取自园区内阳光玫瑰葡萄地块土壤，清除该地块凋落物、石块和葡萄根系等杂质，混匀过筛备用。
栽培园土基本理化性质：速效氮40.95 mg/kg，速效磷32.06 mg/kg，速效钾124.79 mg/kg，pH 7.35。将栽培园土与粉碎的葡萄枝条按照质量比为100∶1（T1），50∶1（T2），30∶1（T3），20∶1（T4）和10∶1（T5）的比例混合均匀，作为试验盆栽基质，以园土栽培为对照（ck）。以一年生“阳光玫瑰”葡萄苗为试材，2019年3月选择长势一致、无病虫害的优质苗木定植于装有上述混合基质的15 L营养钵内（上口径30 cm，高度30 cm，底径20 cm），常规管理。试验包含6个处理，每个处理48株，共计288株苗木。分别于苗木定植后60，90，120，150 d收获，用于各项指标的检测。每个取样时期每个处理随机收获12株，每4株为1次重复，共3次重复。
1.2土壤取样方法
每个取样时期将每个处理的12株苗木随机分成3组（即3次重复），每组4株苗木，将每组的4株苗木去掉营养钵、松动土壤，然后去除根系、凋落物等杂质，过1 mm筛后充分混匀，作为一个土壤样品重复（共计3次生物学重复）。每个生物学重复再按照四分法取样分成3份，分别用于不同指标检测。其中，2份用冰盒迅速带回实验室并保存在-80℃或4℃，用于土壤高通量测序及土壤酶活性分析，1份自然风干、研磨过筛后，用于土壤基本理化性质检测。
1.3研究方法
采用CTAB法提取土壤样品基因组DNA，委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成测序。对真菌ITS1区（Internal Transcribed Spacer1）进行PCR引物扩增。使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR。扩增引物为ITS1-1F-F（5'-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS1-1F-R（5'-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，对目的条带采用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，Germany）进行回收。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit进行文库构建，经过Qubit和Q-PCR定量后使用NovaSeq6000上机测序。下机数据截去Barcode和引物序列，采用FLASH（V1.2.7）拼接，利用Qiime（V1.9.1）质量过滤器过滤合并序列。通过UCHIME Algorithm与物种注释数据库比对，去除嵌合体序列获得最终有效数据。利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001）对上述最终有效数据进行聚类，按照97%的相似度将序列聚类成为OTUs（Operational taxonomic units）。最后，采用Mothur方法与SILVA132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析。每个土壤样品3次生物学重复。
1.4数据统计与分析
所得数据采用IBM SPSS Statistics数据处理软件进行统计分析。本试验采用单因素完全随机试验设计。其中显著性分析采用Duncan's多重比较法（P<0.05）。利用R软件（Version 2.15.3）绘制稀释曲线、Venn图、群落柱形图和真菌属水平相对丰度Heatmap图，并进行主坐标分析（PCoA）。使用Microsoft Excel软件绘制柱形图。图表中数据均为平均值±标准差。
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