摘要
彩绘文物表面滋生的微生物会改变文物的颜色与外貌，破坏彩绘层整体的稳定性，对文物造成严重破坏，但不同颜料上微生物生长的差异性却少见报道。为探究不同颜料上微生物生长的差异性，选取石绿、石青等10种古代常用颜料制作彩绘模拟样品，进行高湿环境（75%~100%RH）的微生物生长模拟实验，利用扫描电镜（SEM）观察微生物微观形貌，运用微生物形态学和分子生物学技术鉴定其种属。实验结果表明，湿度越高，微生物越容易生长；10种颜料上微生物生长顺序依次为群青>朱砂>赭石≈土红>石青≈石绿>铅白>雌黄>雄黄>铅丹；鉴定出颜料上生长的微生物主要有3个真菌属（曲霉属，Aspergillus；青霉属，Penicillium；枝孢菌属，Cladosporium）和1个细菌属（肠杆菌，Enterobacter）。该研究为彩绘文物的湿度环境选择以及微生物防治提供科学依据，对该类文物保护具有重要指导意义。
我国拥有大量珍贵的彩绘文物，如秦始皇兵马俑彩绘陶器、敦煌壁画等，它们拥有重要的文化、艺术和科学价值。然而，微生物的生长会引起彩绘变色、褪色，彩绘层脱落等病害[1-2]。影响微生物病害的主要因素有外界环境、自身材质等。环境湿度对微生物生长影响远大于温度[3]，真菌很少能在<55%RH下存活，>75%RH真菌将生长繁殖[4]。从文物材质来看，彩绘层主要由颜料和胶料组成，不同颜料因其组成成分、理化性质和生产工艺不同，一定程度上对微生物生长起着抑制作用，使微生物生长存在差异性。
从20世纪90年代起，敦煌壁画红色颜料的变色现象引起了人们关注，实验结果表明，土红、铅丹、朱砂颜料上微生物生长程度和变色程度不同，变色最严重的是铅丹[5]。近年课题组发现大足石刻卧佛表面红、蓝、白、绿色颜料中，蓝色颜料群青极易滋生微生物，而绿色颜料氯砷钠铜石和白色颜料砷铅矿表面几乎不长霉[6]。ALI研究发现埃及蓝、朱砂、雌黄和金箔在接种黑曲霉、青霉和芽孢杆菌后，除雌黄外其他颜料均出现明显变色[7]。即使颜料浓度很高、营养条件较差，真菌和细菌仍具有繁殖能力，特别是黑曲霉对颜料的变色影响十分严重[8]。但以往的研究中，颜料种类较少，且多采用在混合有特定颜料的培养基中添加提纯的真菌或细菌的方法进行模拟实验，忽略了颜料-胶料体系与传统生物学培养基的差异和湿度环境因素的影响，无法观察多种微生物共存时不同彩绘微生物生长的差异性。因此，本文扩大颜料种类至石青、石绿等10种古代常见颜料，以常用胶料明胶制成颜料体系，在>75%RH的高湿环境下进行微生物培养，鉴定优势菌种，探讨微生物生长的差异性，该研究对彩绘文物湿度环境选择和微生物防治提供科学依据。
1、材料与方法
1.1、材料与试剂
Tsingke DNA提取试剂盒（西安擎科生物有限公司）；PDA马铃薯琼脂葡萄糖培养基、LB肉汤培养基（南通凯恒生物科技发展有限公司）。实验选择Φ90 mm一次性无菌培养皿制备培养基，培养基配制好后，在37℃真空中培养48 h，确定无污染后方可采样。明胶、土红、赭石（北京金源阳光矿物颜料公司）；群青、石青、石绿（北京金碧斋颜料厂）；朱砂、雄黄、雌黄、铅丹、铅白（苏州姜思序堂颜料公司）；密封箱；载玻片。
1.2、仪器
LEICA S8 APO体视显微镜（德国徕卡公司）；恒温恒湿箱（广东宏展科技有限公司）；VEGA 3XM钨灯丝型扫描电镜（捷克泰思肯公司）。
1.3、实验样品制备及微生物培养方法
实验样品制备方法如下：分别取相同体积的3号粒径的10种颜料于研钵中，边滴加3%明胶水溶液边研磨，研细后涂刷在载玻片上，每种颜料刷涂12片（每组平行样3个）作为实验样品。将上述样品置于西安大气环境中，放置3 d后转移至恒温恒湿箱中，调节温度30℃、相对湿度分别为75%RH、84%RH、93%RH和100%RH进行微生物培养。
1.4、微生物生长表征方法
在微生物培养过程中，每隔一段时间用体视显微镜观察实验样品表面，并拍照记录微生物开始生长的时间。培养30 d或70 d时，观察记录样品表面微生物生长的面积，根据国标GBT24128-2009确定实验样品的微生物生长等级。
1.5微生物种属鉴别方法
1.5.1、SEM分析
实验使用VEGA 3XM钨灯丝型扫描电镜，保持实验电压为15 kV，分析电压为20 kV，工作距离为20 mm，将生长微生物的实验样品固定于导电胶上，观察并研究菌体的微观形貌特征，初步判断微生物类别。
1.5.2、微生物的分离与纯化
在无菌操作台中，使用接种环挑取实验样品上肉眼可见的菌落，接种在空白培养皿上，经30℃恒温培养48 h后挑出微生物菌落于NA平板上用划线法纯化。
1.5.3、微生物基因组总DNA提取及目标片段扩增
使用DNA提取试剂盒对上述分离提纯后的微生物进行基因组总DNA提取。以总DNA为扩增模板，细菌选择通用引物27F和1492R、真菌选择通用引物ITS1和ITS4进行链式聚合酶反应（PCR）扩增。扩增条件：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸10 s，完成35个扩增循环，72℃终延伸5 min。
1.5.4、电泳检测
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2μL样品+6μL溴酚蓝），300 V电压下12 min以获取鉴定胶图，并将其送至擎科生物有限公司测序。
1.5.5、序列比对及系统发育树的构建
将拼接序列与GenBank数据库进行比对，下载最相似的序列进行系统发育树的构建。通过软件ClustalX 2.1进行多序列联配，使用Jukes&Cantor法计算进化距离，用邻位相连法分析后通过软件MEGA 7.0构建系统发育树，通过Bootstrap法对树进行分析[9]。
2、结果与讨论
2.1、微生物生长模拟实验分析与定级
根据国标GBT24128-2009，微生物生长分为5个等级（见表1）。由模拟实验结果可得到10种颜料上微生物生长达到1级的时间（见表2）和70 d达到的等级（见图1）。可以发现：
图1 10种颜料上微生物生长70 d达到的等级
Fig.1 The grades reached by the microbial growth of 10 kinds of pigments for 70 days
下载:原图|高精图|低精图
表1微生物生长等级评价方法
Tab.1 Evaluation method of microbial growth grades
表2 10种颜料上微生物生长达到1级所需时间
Tab.2 Time of the microbial growth to reach level 1 on 10 kinds of pigments
1）各种颜料上微生物生长存在明显的差异性。相同湿度下，在30 C°培养30 d时，颜料上出现微生物的顺序依次为群青、朱砂、赭石/土红、石青/石绿和铅白，而雌黄、雄黄、铅丹上没有观察到微生物痕迹，微生物生长面积为群青>朱砂≈赭石≈土红>石青≈石绿>铅白>雌黄>雄黄>铅丹（仅93%RH条件下朱砂上微生物生长面积略大，其他3组湿度条件，朱砂、赭石和土红微生物生长面积基本相同）；延长培养时间至70 d，雌黄和雄黄上微生物生长等级分别达到2级和1级，铅丹仍为0级。综上所述，各种颜料上微生物生长顺序为群青>朱砂>赭石≈土红>石青≈石绿>铅白>雌黄>雄黄>铅丹。换句话说，颜料对微生物的抑制作用（毒性）顺序与此相反。
2）相对湿度对微生物生长的影响。75%RH环境培养30 d，只有群青样品上微生物生长达到2级，肉眼可观察到明显的微生物菌落；84%RH和93%RH环境中，在朱砂、土红、赭石样品上也可观察到明显的微生物菌落；100%RH环境中，石绿、石青样品上微生物生长等级达到2级。同时，群青样品上微生物重度生长，几乎完全覆盖颜料层。因此，相对湿度越大，微生物越易生长。
2.2、微生物种属鉴别
2.2.1、SEM分析
通过对彩绘样品进行SEM分析，初步判定大量存在、且具有微生物特征的结构有4种（见图2），其中图2A和图2B结构广泛存在于群青、朱砂、土红、赭石、石青和石绿样品中。图2A可观察到网状的菌丝结构，其直径为2~3μm，与霉菌直径接近，远大于放线菌菌丝（直径0.2~1.2μm），推测是霉菌。同时，由图2A还观察到直径为4~5μm的链状卵圆形孢子，推测可能是青霉或曲霉的分生孢子[10-11]；图2B中亦出现大量链状卵圆形孢子，但直径仅为1~3μm，推测为枝孢霉分生孢子[12]。由此，群青、朱砂、土红、赭石、石青和石绿样品中有大量霉菌生长，且霉菌可能为曲霉、青霉和枝孢霉等。铅白、雌黄和雄黄样品中，除出现少量上述图2A和图2B的结构外，还有图2C所示直径0.5~5μm椭圆状和杆状结构，应为原核微生物，推测可能是杆菌。
图2彩绘样品上微生物的SEM照片(×1000)
Fig.2 SEM photos of microorganisms in the polychromy samples(×1000)
A、B为群青样品；C为铅白样品
2.2.2、微生物种属鉴别
将测序所得的18S rRNA和16S rRNA基因序列，通过NCBI网站提交到GenBank数据库中进行Blast分析对比，以鉴定微生物种属，构建的系统发育树见图3、图4，分析结果见表3。
图3彩绘样品基于18S rRNA基因序列的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of the polychromy samples based on 18S rRNA gene sequence
图4彩绘样品基于16S rRNA基因序列的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of the polychromy samples based on 16S rRNA gene sequence
表3彩绘样品微生物序列对比分析结果
Tab.3 Comparative analysis results of microbial sequence of the polychromy samples
结合显微观察和分子生物学测序分析结果，鉴定出群青、朱砂、土红、赭石、石青和石绿样品上主要微生物为产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、杂色曲霉（Aspergillus versicolor）和枝孢霉（Cladosporium sp.），铅白、雌黄、雄黄样品上除以上3种真菌外，还有霍马氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）。
结合以上SEM分析和微生物种属鉴别实验发现，群青、朱砂、土红、赭石、石青和石绿等毒性较小的颜料，其上大面积生长的微生物是青霉属、曲霉属和枝孢霉等真菌，菌丝生长茂盛且殖入彩绘层。但肠杆菌无菌丝，菌落面积小于真菌，其竞争力远低于真菌，无法获取到足够的生存空间，难以生长出肉眼可见的菌落。铅白、雌黄、雄黄毒性强的重金属颜料，对微生物代谢活动的抑制作用大，真菌难以大面积生长，为肠杆菌的生存留出了足够空间。且真菌代谢产生的柠檬酸盐还是霍马氏肠杆菌的碳源和能源。因此，霍马氏肠杆菌可以在真菌难以大量生长的铅砷颜料样品上生长出肉眼可见的菌落。
本模拟实验中检测到的青霉属、曲霉属和枝孢霉属是破坏彩绘文物的主要真菌，3个菌属对应的产黄青霉、杂色曲霉和枝孢霉菌是彩绘文物上的优势菌种，在世界多处文化遗产中常有发现。对于露天彩绘文物，LIIES发现罗马尼亚的一座木质教堂绘画受到青霉和曲霉的严重破坏[13]；Lutsenko检测到圣·索菲亚大教堂中世纪壁画上主要的真菌是青霉，其中优势菌种为产黄青霉[14]。日本高松冢古坟微生物病害严重，虽然进行过多次防治，但微生物优势类群不断变迁，直至当今青霉、曲霉和枝孢霉仍作为优势类群出现。因此，这个曾一度是原址保护的国际典范，正是由于逐渐失控的微生物病害导致古坟解体搬迁至异地保护[15]。国内敦煌莫高窟壁画表面普遍存在着枝孢霉[16]；西安韩休墓壁画检测出青霉和曲霉[17]；太原、酒泉和嘉峪关墓室壁画都存在枝孢霉、曲霉和青霉，且占据优势地位[18]。对于馆藏彩绘文物，葡萄牙Machado de Castro国际博物馆绘画和彩绘雕塑作品上发现了曲霉和青霉属微生物的生长，其中杂色曲霉是优势菌种。同时，在博物馆空气环境中[19]，青霉属、曲霉属和枝孢霉属是最常见的真菌。考古发掘现场遗址微生物繁殖严重，较高的温度、湿度以及较低的空气交换速率是造成微生物大面积污染的主要环境因素[20]。
铅白、雌黄和雄黄样品上还发现了原核微生物霍马氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei），该菌种在文物上比较少见，在葡萄牙Escoural洞窟中被发现[21]。但该菌种隶属的肠杆菌属较为常见，在莫高窟壁画表面白色污染物中肠杆菌属是主要的细菌类群之一[22]。
2.3、微生物生长差异性的影响因素及机制
各种颜料上微生物生长存在差异性的主要影响因素有颜料的化学组成、理化性质、生产工艺以及微生物种类等。
1）群青，为复杂的铝钠的硫硅酸盐。色相不同，化学组成亦不同，如深色群青为Na8Al6Si6O24S4，群青具有良好的亲水性，高湿环境吸收的水分为微生物生长提供有利条件。群青耐酸性差，微生物代谢产生的有机酸会进一步破坏其结构。同时，Si、Al、O、Na等土壤常见元素，对微生物活性几乎没有抑制作用，大部分空气微生物能无阻碍地迅速生长。因此，在所研究的10种颜料中，群青颜料上微生物生长最茂盛，这是大足石刻卧佛上群青颜料微生物滋生最严重的原因[7]。
2）朱砂，本实验发现朱砂（HgS）对微生物生长的影响较小。汞化物的毒性中，有机汞>汞>无机汞，有机汞可以直接被有机汞裂解酶分解为细胞吸收，有剧毒[23]；汞单质和无机汞需要进行甲基化/乙基化等有机化反应后才能被细胞吸收毒害微生物。朱砂为无机汞，难溶于水游离出Hg2+，毒性较小。
朱砂对微生物的破坏主要是Hg2+在细胞内积累产生毒性。研究表明，青霉和曲霉能吸收转化Hg2+，尤其是杂色曲霉[24-25]。杂色曲霉上汞的吸附主要是胞外积累，氨基、羧基和羟基的络合作用使其定位于细胞壁上，从而隔绝汞进入胞内，杂色曲霉胞外积累的特性使其几乎无损地吸收Hg2+。因此，朱砂对微生物的毒性与Hosfall提出的金属阳离子毒性排序中Hg2+的强毒性有较大差异[23]。
3）土红、赭石、石青、石绿，土红和赭石富含氧化铁，石青和石绿含碳酸铜。Cu2+是重金属离子，其毒性大于Fe3+。因此，土红和赭石上微生物生长速度和面积要大于石青和石绿。
4）雌黄、雄黄、铅丹、铅白，雄黄（As2S2）和雌黄（As2S3）为砷的硫化物，铅丹和铅白为含铅的氧化物和碳酸盐。砷和铅为重金属，颜料毒性强，会严重抑制微生物生长，这与大足石刻卧佛上含砷、铅的绿色和白色颜料表面几乎不长霉相吻合。然而，含砷、铅颜料对微生物生长的抑制作用存在差异。这种差异除与颜料化学组成有关外，还与颜料生产工艺、微生物种类等因素有关。
据现有研究，雄黄含有一定量砒霜，其毒性强于雌黄，因而微生物在雄黄上比雌黄上更难以生长[26]。铅白的原矿是白铅矿，常与磷氯铅矿共生，共生矿导致铅白对微生物的毒性降低。相比而言，铅丹多为人工合成，纯度高、杂质少，毒性强于铅白。邓新辉研究表明，产黄青霉菌代谢产生的草酸和柠檬酸等有机酸能促进铅白转换成残渣态铅，间接削弱其毒性[27]。因此，铅白上微生物生长速度快于雌黄、雄黄和铅丹等其他砷、铅重金属颜料。
微生物在颜料上的生长与环境、样品制作工艺等多种因素有关，即便是同一种颜料，这些因素的不同也会导致颜料上徽生物生长有所差异。本研究的10种颜料中，铅丹对微生物的抑制作用最强，微生物最难生长。古人将防蠹纸装潢在书籍的扉页或封底以保护书籍不受虫蚀。现收藏于国家博物馆的《梦溪笔谈》（明代崇祯4年，1631年）和《羊城古钞》（清代嘉庆11年，1806年）2本书都衬有这种“万年红纸”，至今仍完好无损，而没有万年红纸之处，却遭到蠹蛀。
3、结语
10种古代常见颜料上微生物生长存在差异性，微生物生长顺序依次为群青>朱砂>赭石≈土红>石青≈石绿>铅白>雌黄>雄黄>铅丹。在75%~100%RH范围，湿度越高，微生物生长越快，对颜料的侵蚀越严重。高湿环境中彩绘文物上滋生的主要微生物菌属有曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、枝孢菌属（Cladosporium）和肠杆菌（Enterobacter）。建议在含群青颜料的彩绘文物上，特别应控制环境湿度，以减少微生物的生长；而雄黄、铅丹等含砷、铅颜料毒性强，可适度放宽湿度范围。应根据彩绘文物颜料的种类，针对性地控制环境湿度，并采取有效的治理措施。