2结果与分析
2.1窖泥中酯化菌富集方法的优化
窖泥经不同富集时间、不同富集次数富集后，采用HSSPME-GC-MS检测富集液中酯类物质含量和种类数的变化，结果见图1。
图1富集时间（a）及富集次数（b）对富集液中酯类化合物含量和种类数的影响
由图1a可知，随着富集时间的延长，窖泥富集液中酯类物质种类数和含量均呈先增加后稳定的变化趋势。富集16 d时，窖泥富集液中酯类物质种类数达到11种，酯类物质总含量达到199 mg/100 mL，均显着高于富集前期（P＜0.05）。富集16 d后，随着富集时间的延长，窖泥富集液中酯类物质种类数和含量均趋于稳定，变化不显着（P＞0.05）。这可能是由于富集16 d后目标菌群进入稳定期，随着营养物质消耗及富集液中微生物代谢产物的积累，目标菌群生长受到抑制逐渐进入衰亡期。
由图1b可知，随着富集次数的增加，窖泥富集液中酯类物质含量呈先上升后降低的变化趋势，富集2次时，酯类化合物含量达到最大（280 mg/100 mL），显着高于1次富集（P＜0.05）；而酯类物质种类数随富集次数增加呈下降变化，富集2次时酯类物质种类数为8种，随后趋于稳定，变化不显着（P＞0.05）。这可能是由于第一次富集液中产酯微生物种类丰富但生物量较少，导致其代谢产物酯类物质种类数多而含量较少，随着富集次数增加，富集液中微生物逐渐被驯化，部分微生物被淘汰，优势产酯微生物愈加的集中，使得富集液中的酯类物质种类数趋于稳定而含量升高。因此，窖泥富集液富集培养16 d，富集2次有利于酯化菌的富集。但为保证目标微生物的富集效果，略微延长富集时间，选择富集时间为20 d。
2.2窖泥中酯化菌的分离与筛选
采用稀释平板涂布法从优化后的窖泥富集液中分离出23株菌，再通过HS-SPME-GC-MS检测复筛出3株代谢生产己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，分别命名为Y1、Y2、Y3。
2.3酯化菌的鉴定
2.3.1形态观察
3株菌株的菌落、细胞形态及其革兰氏染色结果见图2。
图2 3株菌株的菌落（a）及细胞（b）形态
由图2可知，3株菌皆为厌氧的革兰氏阳性（G+）白色杆状细菌。菌株Y1的菌落呈米白色、正反面颜色一致、边缘规整、圆形、外观形态小，细胞呈杆状、有一定的排列方式，革兰氏阳性，厌氧；菌株Y2的菌落呈灰白色、菌落中间颜色较浅、边缘颜色较白、较光滑、比较湿润、不易于挑取，细胞呈杆状，G+，厌氧；菌株Y3的菌落呈黄白色、湿润、光滑、不透明、外观形态小、易于挑取，细胞呈杆状，G+，厌氧。
2.3.2生理生化鉴定结果
3株菌株的生理生化试验结果见表1。
表1 3株菌株的生理生化鉴定结果
由表1可知，菌株Y2水解淀粉结果为阴性，菌株Y3的接触酶试验结果呈阴性，除此之外，3株菌株的其他生理生化反应试验结果均呈阳性。结合形态观察，初步鉴定菌株Y1、Y2、Y3均为厌氧梭菌属（Clostridiumsp.）。
2.3.3分子生物学鉴定结果
菌株Y1～Y3纯化后提取基因组DNA，以其为模板进行16S rDNA的扩增，采用1%琼脂糖凝胶进行检测，结果见图3。
图3 3株菌株16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
由图3可知，3株菌株的16S rDNA PCR扩增产物的碱基长度为1 600 bp左右，与预期结果相符，委托上海美吉公司进行测序。将测序结果提交至NCBI的GenBank数据库中进行Blast比对搜索，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0中的NJ法构建系统发育树，结果见图4。
图4基于16S rDNA基因序列3株菌株的系统发育树
由图4可知，菌株Y1与拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）聚于一支，亲缘关系最近；菌株Y2与Clostridium guangxiense聚于一支，亲缘关系最近；菌株Y3与Clostridium sartagoforme聚于一支，亲缘关系最近。结合形态观察及生理生化试验结果，鉴定菌株Y1、Y2、Y3分别为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、Clostridium guangxiense、Clostridium sartagoforme。有文献报道，C.beijerinckii、C.guangxiense能发酵产丁醇，特别是C.beijerinckii能够利用糖质和木质素水解液发酵产丁醇，在用生物法来生产丁醇中得到广泛应用；C.sartagoforme是一种纤维素（和几丁质）降解细菌。
3株酯化菌均为厌氧梭菌，这可能是由于梭菌在优质窖泥中已经是优势微生物，经过富集培养基多轮次富集，在富集液中占据主导地位，这也表明窖泥中的梭菌可能为浓香型白酒酿造中重要的酯化生香菌。因此，加强这3株菌的研究对提升白酒质量具有重要意义。
2.4酯化菌培养条件试验结果
2.4.1 3株菌株的生长曲线
为了解菌株Y1、Y2、Y3的生长情况，在厌氧条件下测定3株菌株的生长曲线，结果见图5。
图5 3株菌株厌氧条件下的生长曲线
由图5可知，3株菌株的生长趋势一致，生物量均呈先上升后稳定再下降的变化趋势，其中前24 h为延滞期；24～64 h为对数生长期；64～80 h为平稳期；80 h后进入衰亡期。这可能是由于前24 h菌株正在适应新的培养液环境，大量合成细胞分裂所需的酶类及其他细胞成分，细胞生长但不分裂，培养液中生物量不变；24 h后菌株已适应新的生长环境，丰富的营养物质使它们快速生长繁殖；64 h后培养液中的大部分营养物质被消耗以及代谢产物的累积，使得部分微生物消亡，此时微生物的增长和消亡趋于稳定，3株菌株生物量保持稳定；80 h后培养液中可利用营养物质完全被利用，微生物逐渐消亡。
2.4.2 3株菌株最适生长温度、pH及耐乙醇能力试验
通过紫外分光光度计检测菌株Y1～Y3经不同温度、不同pH值及不同体积分数乙醇培养后的OD660nm值，结果见图6。
图6温度（a）及pH值（b）对3株菌株生长的影响及其耐乙醇能力（c）
由图6可知，随着培养温度、pH值的升高，3株菌株的生物量均呈先增加后降低的趋势，且3株菌株均在温度为30～41℃、pH值为5～10、乙醇体积分数为2%～8%的范围内生长良好。其中，菌株Y1的最佳生长温度为30℃、最适生长pH值为5、耐受乙醇体积分数为23%；菌株Y2的最佳生长温度为34℃、最适生长pH值为7、耐受乙醇体积分数为20%；菌株Y3的最佳生长温度为37℃，最适生长pH值为5、耐受乙醇体积分数为20%。
3株菌株均能在窖池环境中良好生长，这与筛选环境有关。菌株Y1～Y3来自浓香型窖池底部的优级窖泥，长期处于酿酒环境使得3株菌不断被驯化，具有较高的耐乙醇能力。此外，这3株菌的最佳生长温度在30～37℃，这可能表明它们主要生长在浓香型白酒的发酵的高温期，窖池内糟醅发酵温度分为“前缓、中挺、后缓落”三个阶段，其中中挺阶段发酵温度一般在30℃以上。
3结论
本试验对窖泥酯化菌的富集方法进行优化，发现富集液培养20 d、连续富集2次，富集液中酯化菌的富集效果最好。采用传统分离方法从优化富集液中分离、筛选得到3株产己酸乙酯和丁酸乙酯较强的酯化菌，经形态观察、生理生化试验及分子生物学技术鉴定菌株Y1为Clostridium beijerinckii、Y2为Clostridium guangxiense、Y3为Clostridium sartagoforme。通过对3株菌株的生长特性研究发现，菌株Y1的最佳生长温度为30℃、最适生长pH值为5、耐受乙醇体积分数为23%；菌株Y2的最佳生长温度为34℃、最适生长pH值为7、耐受乙醇体积分数为20%；菌株Y3的最佳生长温度为37℃，最适生长pH值为5、耐受乙醇体积分数为20%。3株菌株均能在浓香型白酒窖内进行很好的生长繁殖，加强这3株菌株的研究对提升浓香型白酒糟醅质量具有重要作用。
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