稻曲病由稻曲病菌（Villosiclava virens，无性态为Ustilaginoidea virens）引发。稻曲病菌为肉座菌目、麦角菌科、绿核菌属真菌。该菌在水稻孕穗早期侵染水稻幼穗，从花丝顶部侵入，然后朝花丝基部扩展，在籽粒灌浆中后期形成稻曲球。稻曲球表面可产生大量厚垣孢子，还可形成若干菌核。稻曲病菌侵染水稻后会吸收寄主的营养物质用于自身生长发育，从而导致稻谷空粒，造成水稻减产。此外，稻曲球还含有对人、动物和植物均有一定毒性的毒素，严重影响稻米品质。
由于大面积推广种植的水稻品种缺乏抗性以及气候变化等原因，近年来，稻曲病的发生呈现不断加重的趋势。该病已由一种零星、偶发性病害逐渐发展成为一种水稻主要病害。在我国，此病在东北、西南和长江中下游稻区危害较重，主要发生于晚稻上。在其他亚洲国家或地区，以及美洲和非洲，亦有此病大面积发生的报道。
稻曲病菌虽然属于活体营养型病原真菌，但不能进入寄主细胞内部，不能产生吸器类结构，侵染模式为典型的细胞外侵染和扩展，其向水稻深层组织的扩展由菌丝完成。目前关于稻曲病菌菌丝生长调控的研究仍非常薄弱，对该菌菌丝的生长受到哪些因子调控及涉及的调控机制了解不多，导致研究者对该菌在水稻深层组织中扩展的调控机制不甚明确。
研究已证实照光可影响一些真菌的生长发育，但关于照光对稻曲病菌的影响尚存在争议。有研究报道，稻曲病菌菌核在黑暗中萌发的菌丝只产生分生孢子；而在充分照光条件下萌发的菌丝可形成子实体，产生子囊孢子，表明照光对该菌的生殖过程有重要影响。然而，液体培养菌丝的产孢过程不受照光影响，不管照光与否都只产分生孢子，且孢子产量无差异。照光被报道可诱导固体培养菌丝产生厚垣孢子，而黑暗条件下基本不产孢；另有研究给出了相反结论，即黑暗条件下可产生大量厚垣孢子，而照光条件下不产孢。对于稻曲病菌菌丝，有研究报道照光可抑制其生长，也有文献则报道照光对其无影响。上述研究结论的诸多不一致表明，关于照光对稻曲病菌生长发育的影响尚待开展更多、更细致的研究予以明确。
鉴于此，本研究比较了照光和黑暗条件下稻曲病菌菌丝在固体培养基上的生长状态，并应用转录组测序技术，比较了上述2组菌丝的基因整体表达情况，分析了照光引起的差异表达基因。本研究的结果有助于明确照光对稻曲病菌菌丝生长的影响，增进人们对该菌菌丝生长调控机制的认识，为水稻生产中科学、高效地防控稻曲病奠定理论基础。
1材料与方法
1.1试验菌株与培养方法
试验材料为稻曲病菌ZJ09菌株，从田间水稻病株上采集稻曲球并进行多代单菌落分离纯化后得到。
菌株培养方法：取马铃薯蔗糖琼脂（potato sucrose agar,PSA）培养基平板上正常生长15 d的稻曲病菌，用直径为5 mm的打孔器沿着菌落边缘打取菌碟，接种于新的PSA平板中央，分成黑暗组与照光组2组，黑暗组培养于保持黑暗条件的培养箱中，照光组培养于用日光灯提供白光（光照强度为4 000 lx）的培养箱中，温度均为28℃。分别于培养7、15、20 d后取培养物用显微镜观察和拍照，采用十字交叉法测量菌落直径，每个时间点每组均观测6皿。凡用于测量菌落直径的PSA平板在测量完后均终止培养。用铁勺分别从培养20 d的黑暗组与照光组PSA平板上刮取菌丝，用锡箔纸包好，立即用液氮快速冷冻，随后送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行转录组测序。在转录组试验中，黑暗组与照光组均设2个重复，每个试验重复至少含3皿PSA平板培养物，作为生物学重复。
1.2转录组试验方法
1.2.1 cDNA文库的构建及转录组测序流程
采用Oligo（dT）磁珠法富集稻曲病菌菌丝样本总RNA中带有多聚A（poly A）的mRNA，再加入二价金属离子溶液，将其打断成长200～300碱基的片段。继而用6碱基随机引物和反转录酶合成cDNA第1链，以第1链cDNA为模板合成第2链，第2链的cDNA的碱基T被替换为碱基U，获得链特异性文库。文库构建完毕后，采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增进行片段富集，再根据片段大小（300～400 bp）进行选择。使用Agilent 2100 Bioanalyzer对得到的文库进行质检，检测文库的总浓度及有效浓度。根据文库有效浓度及所需数据量，将含有不同Index序列的文库按比例混合，统一稀释至2 nmol/L。最后，采用第2代测序技术（next-generation sequencing），基于Illumina HiSeq测序平台，对所得文库进行双末端测序。
1.2.2转录组测序数据分析
上述得到的文库经上机测序，得到图像文件，再由测序平台自带软件进行转化，获得FASTQ格式的原始下机数据（raw data），统计每个样品的碱基识别准确率。将原始数据采用Cutadapt进行过滤，去除3′端的接头，获得高质量识别序列（clean data），使用Tophat软件将其与稻曲病菌“UV-8b”参考基因组序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/31935?genome_assembly_id=59177）进行比对，默认识别序列（reads）和参考基因组序列的错配个数在2个之内，即为比对（mapping）成功。拼接比对成功的识别序列，还原出转录本序列。
对于使用Tophat软件比对成功的序列，利用Cufflinks-2.2.1（http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks），通过计算每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per million base pairs sequenced,FPKM）来对基因表达进行定量；利用Cuffdiff分析模块筛选差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs），筛选标准为|log2（差异倍数）|＞1，且Q＜0.05，其中，差异倍数=照光组样品基因表达量/黑暗组样品基因表达量。
随后，对筛选到的DEGs进行基因本体（gene ontology,GO）功能显著性富集分析，把所有DEGs向GO数据库（http://www.geneontology.org）的各个分类映射，计算每个分类的基因数目，得到DEGs显著富集的GO类别（term）。
此外，利用京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）公共数据库，使用软件KOBAS 2.0对筛选到的DEGs进行KEGG通路（pathway）注释，获得通路显著性富集结果。
1.3用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）验证转录组测序结果
以稻曲病菌的α微管蛋白-1编码基因作为内参基因，选取6个表达丰度较高的DEGs，其中上调和下调的基因各3个（表1），进行RT-qPCR，以验证本研究中转录组测序筛选出的DEGs的可靠性。用NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的在线引物设计工具Primer-Blast来设计引物，引物序列见表1。用铁勺从培养20 d的黑暗组与照光组PSA平板上分别刮取菌丝，用Trizol法提取总RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒（日本东洋纺公司）进行反转录，获得cDNA。用SYBR Green QPCR主混料试剂盒（日本东洋纺公司）进行RT-qPCR，仪器为Mastercycler epgradient S型荧光定量PCR仪（德国Eppendorf公司）。PCR扩增体系（20μL）：SYBR Green定量PCR主混料10μL，10μmol/L上下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH2O 6.4μL。PCR扩增程序：95℃预变性60 s；95℃变性10 s，60℃延伸30 s，40个循环。基因的相对表达量采用2－△△CT法计算。
表1实时荧光定量PCR试验所用引物
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