3.TmFae-PETase和已报道PET水解酶的PET降解能力比较
系统进化分析中发现TmFae-PETase与FsC在同一分支（图3a）。TmFae-PETase能降解PET塑料并其转化为MHET和TPA等产物（图3b）。为评估TmFae-PETase的PET水解能力，将其与已报道的PET水解酶进行功能比较，从系统发育树的每个分支上选择一个代表性的PET水解酶，分别是IsPETase、FsC和LCC。TmFae-PETase、IsPETase、FsC和LCC对PET降解结果表明，在35℃下TmFae-PETase的PET降解能力高于FsC，而低于IsPETase和LCC。然而，IsPETase的PET降解活性在反应3天后下降，说明其在较长时间下稳定性差。反应7天后，TmFae-PETase降解PET时所释放的产物MHET和TPA的浓度与IsPETase的几乎相等（图3e）。TmFae-PETase对PET塑料的降解能力随时间而增高，在反应10天后，降解产物MHET的浓度高于其他酶，而LCC的PET降解产物TPA浓度最高（图3c）。在50℃下，TmFae-PETase的PET降解能力高于35℃，降解产物MHET和TPA的浓度高于IsPETase和FsC，但低于LCC（图d，f）。在较高的温度，TmFae-PETase和LCC的PET降解产物TPA的浓度高于MHET。TmFae-PETase具有水解MFA和MCA能力，已知的其它PET降解酶是否具有水解这两种底物的能力还待探索。如图3（g,h）所示，IsPETase和LCC对MFA的水解活性高于TmFae-PETase，而TmFae-PETase和IsPETase对MCA的水解活性最高。
图3.TmFae-PETase与已知PET水解酶的活性比较。(a)基于TmFae-PETase和已知PET水解酶氨基酸序列的系统发育树;(b)HPLC检测PET降解产物MHET和TPA;(c,d)TmFae-PETase、FsC、IsPETase和LCC在PET降解过程中分别释放TPA和MHET产物的量;(e,f)TmFae-PETase、FsC、IsPETase和LCC在35°C和50°C下水解PET的总释放产物(MHET和TPA);(g,h)TmFae-PETase和已知PET水解酶在35℃下MFA和MCA水解过程中分别释放FA和CA产物的量。
4.基于定点诱变和MD模拟的TmFae-PETase催化机制
TmFae-PETase的结构预测显示存在8个α螺旋和7个β折叠，与阿魏酰酯酶LP_0796（PDB：7EBO）高度相似，基于190个Cα原子的均方根差（RMSD）为0.582Å。均方根波动（RMSF）分析确定了四个具有显著灵活性的区域，标记区域为A-D，尤其是在活性位点和TmFae-PETase的额外α螺旋周围（图4a、b）。这种灵活性，特别是在区域B（最大RMSF为1.70Å）和D（最大RMSF为1.40Å）以及活动位点环区域A（最大RMSF为0.97Å）中，有助于底物的进出。尽管存在额外的螺旋结构，但TmFae-PETase仍能有效降解PET。TmFae-PETase与PET二聚体的分子对接表明，残基Y26和M97促进了关键的氢键相互作用，残基S96、D196和H226起催化作用（图4c）。针对该酶的18个关键位点进行了定点突变实验，结果显示14个突变体导致PET水解活性降低了30%~80%。特别是，突变体S96A、D196A（不溶性蛋白）、H226A、Y26A和M97A显示PET、MFA、MCA和p-NPB水解显著降低（图4d），表明这些残基对于维持TmFae-PETase的活性至关重要，可能以类似的模式形成PET、MFA、MCA和p-NPB的底物结合位点。相反，只有三个突变体，即L95W、P122W和P125A显著提高了PET降能力。值得注意的是，在50°C时，L95W降解PET释放的MHET和TPA产量比WT高两倍。此外，这三种突变体引起的二级结构变化很小（图4h），并且对Tm值（72.5–75.9°C）没有显着影响（图4i）。为了进一步研究突变如何影响酶的PET水解活性，分析了TmFae-PETase活性位点周围的环，特别是通过模型预测检查了由三个突变体（L95W、P122W和P125A）和WT引起的相互作用模式的变化（图4f）。通过将L95和P122突变为疏水性氨基酸W，该酶的疏水性以及与PET的π-π相互作用增加。与WT相比，L95W、P122W和P125A的C区和D区的RMSF值较低（图4g），表明结构稳定性增强。四个疏水残基Y26、M95、W122和W125）似乎显著影响WT或突变形式的结合亲和力。L95W和P122W与PET二聚体的结合亲和力强于WT，表明它们在增强底物结合亲和力方面发挥关键作用。
图4.基于定点诱变和MD模拟的TmFae-PETase催化机制。（a）具有PET复合物系统的TmFae-PETase的RMSF，用不同颜色突出显示与活性位点区域相对应的峰;（b）TmFae-PETase的晶体结构显示为卡通（浅黄色），TmFae-PETase上A-D区的配色方案对应于图a中所示的相同图案;（c）使用PET二聚体的TmFae-PETase残基Y26和M97之间的氢键距离;（d，e）WT和TmFae-PETase突变体在35°C和50°C时的PET水解活性;（f）WT和突变体（95W、125A和122W）的特异性驻留（L95、P125和P122）替换的结构分析，其中WT为黄色，突变体为浅粉红色;（g）WT与突变体L95W、P122W和P125A的RMSF比较，每个系统包括蛋白质和PET二聚体;（H，I）TmFae-PETase和突变体L95W、P125A和P122W的CD色谱图和Tm。注意：WT=野生型。
5.优化TmFae-PETase的PET降解能力
为了探索PET降解的最佳条件，研究了pH值、温度和盐度对TmFae-PETase的影响。在60°C时，TmFae-PETase表现出最高的PET水解活性，与30°C相比，MHET和TPA的总量增加了160倍（图5a）。该温度与PET的玻璃化转变温度（≈70°C）非常相似，这有利于PET的酶促降解。结果表明，温度对TmFae-PETase有明显影响。在pH 8.0时观察到TmFae-PETase的最大PET水解活性，导致总MHET和TPA的量比pH 7.0和10.0时高出五倍（图5b）。同样，IsPETase、FsC和LCC的PET水解活性的最佳pH值在8.0至9.0之间。即使酶浓度超过1.0μM，TmFae-PETase的PET水解活性也保持稳定（图5c）。然而，反应5天后，PET水解活性在2.0μM的酶浓度下增强，表明较长的处理持续时间需要更高的酶浓度。TmFae-PETase在0至10 mM的盐浓度范围内显示出最佳的PET水解活性，随着NaCl浓度的增加，活性逐渐降低（图5d）。PET剂量测试显示，在50°C下，TmFae-PETase的水解活性在PET浓度为50 mg·mL–1下进入稳定期，解聚速率为0.7 mgMHETeq h–1·mg酶–1和0.2 mgTPAeq h–1·mg酶–1（图5e）。高温条件下，MHET和TPA的产量随着与TmFae-PETase反应时间的进行而增加（图5f），表明该酶在较长时间内保持高稳定性。
图5.通过TmFae-PETase优化PET降解的操作参数表征。（a）温度对TmFae-PETase水解PET的影响;（b）pH值对30°C时PET降解的影响;（c）在30°C下，不同酶浓度在第2天和第5天释放的累积产物浓度;（d）盐度（NaCl）对30°C下PET水解的影响;（e）TmFae-PETase在50°C下对各种浓度的PET的特异性水解活性;（f）30°C和50°C下产物释放的时间进程比较（初始PET浓度为6 mg·L–1酶0.7μM）。
6.TmFae-PETase对消费后PET（Pc-PET）废物的解聚
为评价TmFae-PETase的实际应用，收集饮料瓶（1#、2#）、食品包装（3#、4#、5#）和6孔板包装（6#）六类pc-PET废弃物，评价TmFae-PETase及其突变体L95W的性能。两种酶都可以降解所有测试的pc-PET废物。然而，与饮料瓶pc-PET废料（1#、2#）相比，它们对3#、4#、5#和6#型表现出卓越的降解能力（图6a）。其水解产物MHET和TPA的浓度比pc-PET瓶废料（1#和2#）的浓度高200倍以上（图6c）。目视和SEM观察表明，用TmFea-PETase处理的pc-PET废物表面变得不透明，形成明显的孔洞，而未经酶处理的pc-PET保持光滑透明（图6d）。饮料瓶pc-PET 1#和2#的结晶度分别为18.3%和34.1%，而包装#3至#6的pc-PET结晶度相对较低，低于12.0%（图6b）。pc-PET 1#和2#的Mn和Mw分别为29300和32200 Da，以及53900和53300 Da，高于#3至#6的pc-PET废物类型，Mn范围分别为17100至26400 Da，分子量范围分别为37300至47000 Da，导致瓶pc-PET的酶降解效率较低（图6e，f）。
图6.野生型TmFae-PETase和突变体L95W的性能比较。（a）WT和L95W根据产物释放浓度（μM）降解六种类型的pc-PET废物;（b）通过XRD分析确定的6种pc-PET废物的结晶度;（c）WT和L95W在pc-PET废料水解过程中释放的MHET和TPA产物的量;（d）未经处理的pc-PET和TmFae-PETase处理的PET废物#至6#表面形貌的SEM观察;（e，f）pc-PET废料的酶降解、结晶度和分子量之间的相关性。注意：WT=野生型TmFae-PETase;L95W=突变体L95W。
本研究引入了一种从黄粉虫的塑料降解肠道微生物组中筛选塑料降解酶的创新方法，从而扩大了现有的塑料降解酶库。此外，这些发现还有助于了解昆虫的肠道微生物群降解木质纤维素如何作为筛选塑料降解酶的潜在候选者的宝贵资源。这种相关性突出了木质纤维素和塑料降解之间潜在的交叉功能，为酶的发现及其在解决塑料废物管理方面的应用开辟了新的可能性。
新筛选PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳条件、实际应用（一）
新筛选PET塑料降解酶表征、降解能力、最佳条件、实际应用（二）