目的探讨生长抑制因子5（ING5）抑制肺癌细胞增殖的作用。方法采用慢病毒介导的基因转染方法建立A549细胞ING5高表达细胞系A549-ING5-OE和A549细胞空质粒对照细胞系A549-control。采用细胞增殖实验和克隆形成实验观察ING5过表达对肺癌A549细胞增殖能力的影响；采用皮下接种方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察ING5对裸鼠皮下成瘤能力及肿瘤体积大小的影响。结果本实验成功构建了肺癌A549-ING5过表达细胞系，与A549-control比较，细胞系A549-ING5-OE中ING5表达显著增高；增殖实验结果显示ING5高表达显著抑制了肺癌细胞的增殖能力；克隆形成实验结果显示细胞系A549-ING5-OE中ING5高表达的肺癌细胞克隆形成能力明显低于A549-control肺癌细胞（P＜0.01）；裸鼠在体水平研究结果显示ING5高表达可以抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长。结论ING5可以抑制肺癌细胞的增殖，为临床治疗肺癌提供新的治疗靶点。
肺癌的发生是个涉及多基因改变的复杂过程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是两大关键要素。生长抑制因子（inhibitor of growth，ING）作为候选抑癌基因家族在肿瘤发生、发展中起重要抑制作用，目前已发现5个成员，包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5。ING编码的蛋白在结构上具有相似性，功能上存在共同的作用，ING蛋白参与磷脂酰肌醇介导的脂类信号通路及激素介导的通路，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡和DNA损伤修复，同时ING蛋白也具有各自的特点］。在多种肿瘤中ING家族基因的表达均下调，已有的研究表明，在肝癌的发生、发展中ING1、ING2、ING4均起到重要作用。ING5作为家族的最新成员于2003年被首次报道。2006年Cote课题组研究揭示ING5参与构成两种组蛋白乙酰基转移酶（HAT）复合体，并且能与组蛋白结合而作为连接HAT与组蛋白的桥梁分子参与组蛋白修饰和染色质重构，表明ING5可通过辅助HAT表观调控基因表达而发挥抑癌作用。ING5与临床肿瘤发生的关系研究表明，61%的原发口腔肿瘤组织中ING5 mRNA水平降低，31例中有3例检测到ING5基因发生突变；在肝癌组织中ING5 mRNA表达量下降，起到抑癌基因的作用；在食管鳞癌组织中ING5 mRNA的表达量同样下降。进一步研究表明ING5可与P53相互作用，并促进P53转录活化，而引起结肠癌细胞周期阻滞和凋亡。但ING5在肺癌中的作用尚未见报道，本实验拟建立ING5高表达肺癌细胞株，采用细胞增殖、克隆形成及裸鼠皮下荷瘤模型探讨ING5对肺癌细胞的抑制作用。
1材料与方法
1.1材料
A549细胞（中科院上海细胞库），GV218载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司，蛋白定量试剂盒、SDSPAGE凝胶配制试剂盒、细胞裂解液均购自西安碧云天科技生物有限公司，蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche，G418购自美国Gibco，细胞培养液DMEM高糖、胎牛血清、胰蛋白酶消化液均购自美国HyClone，青链霉素混合液购自北京Solarbio，ING5抗体购自美国Proteintech，ECL化学发光试剂盒购自美国Advansta，兔二抗购自英国Abcam，电子游标卡尺购自哈尔滨量具刃具有限责任公司，4%多聚甲醛购自西安科昊生物技术有限公司，裸鼠由第四军医大学（以下简称“我校”）实验动物中心提供。
1.2 GV218慢病毒载体转染构建A549-ING5-OE和A549-control细胞系
含ING5 cDNA的慢病毒载体和对照载体为吉凯公司构建。用胰蛋白酶消化液消化293T细胞，计数，调整细胞密度为6×105个/mL，接种于细胞培养皿，待细胞密度达80%时进行转染。转染前2 h将培养液换成无血清培养液，将转染复合物加入293T细胞培养液中，培养8 h后弃掉含有转染复合物的培养液，用PBS清洗细胞，加入10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养。48 h后收集293T细胞上清液，1000 r/min离心除去细胞碎片，收集上清即为病毒颗粒浓缩液。对数生长期A549细胞，培养液中加入病毒颗粒浓缩液进行感染，12 h后观察细胞状态，没有明显的细胞毒副作用，继续培养24 h后更换新的培养液，感染3 d后观察GFP基因的的表达。感染后A549细胞计数，调整密度为300个/孔，接种至6孔板，用G418筛选，药物浓度为5μg/mL，每隔24 h更换新的培养液，筛选3 d后，用荧光显微镜观察细胞克隆，挑取阳性克隆扩大培养，直至获得需要的细胞量。
1.3 Western blot检测ING5在A549-control和A549-ING5-OE细胞中的表达
收集对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞在冰上裂解30 min，细胞裂解液为150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5%去氧胆酸、0.1%SDS、50 mmol/L Tris（pH 8.0），蛋白酶抑制剂（1∶25），裂解后高速离心20 min，收集上清即为细胞总蛋白，蛋白定量试剂盒定量。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配制10%的凝胶。电泳，样品在浓缩胶电压100 V，20 min，在分离胶电压120 V继续电泳。转膜，电压55 V，210 min，转膜结束后用丽春红染液染色，PBST脱色。牛奶封闭1 h，一抗ING5（1∶1000）封闭4℃过夜。PBST洗3次，每次5 min，二抗封闭1 h，PBST洗3次，每次5 min。用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（Amersham Bioscience）检测蛋白的表达。
1.4检测ING5对肺癌细胞增殖的抑制
将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整细胞密度为1×104个/孔，接种至24孔板，两种细胞各种4个复孔，每孔加1 mL 10%胎牛血清DMEM培养液。从细胞贴壁开始计时24、48、72、96 h后各计数1次。
1.5检测ING5对肺癌细胞克隆形成能力的抑制
将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整细胞密度为300个/孔，接种至6孔板，每孔加2 mL 10%胎牛血清DMEM培养液。细胞接种5 d后每孔各加500μL胎牛血清继续培养。贴壁生长15 d后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%结晶紫溶液染色15 min，PBS轻轻冲洗细胞，室温风干后计数多于50个细胞的克隆。根据公式计算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆数/300×100%。
1.6 ING5抑制裸鼠皮下成瘤实验
出生4周雄性裸鼠，对照组和实验组各7只随机分组，由第四军医大学（以下简称“我校”）实验动物中心代养。裸鼠适应7 d后，将对数生长期A549-control和A549-ING5-OE细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整密度为每只裸鼠5×106个/200μL，混匀在无血清DMEM培养液，分别接种至对照组和实验组裸鼠皮下。7 d后裸鼠皮下成瘤，每隔3 d用电子游标卡尺测1次移植瘤长径（a）和短径（b），并计算肿瘤体积（V）：ab2/2，绘制肿瘤生长曲线。裸鼠实验遵循我校关于动物保护和做好动物福利规定，并经我校实验动物伦理委员会批准。
1.7统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
相关新闻推荐
1、高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——结果
2、副鸡禽杆菌生长曲线测定方法：分光光度法VS菌落计数法（二）
3、金黄短杆菌CT-A16生长曲线及对主要食用菌病害的生防机制——摘要、材料与方法