3讨论与结论
桑椹菌核病发病率高，防治困难，极大影响桑果产量与品质。利用健康桑树内生菌进行桑椹菌核病的绿色防控，不仅有利于促进产业健康发展，更能满足人们的食品安全要求。本研究分离获得一株对桑椹菌核病病原菌具稳定拮抗作用的内生细菌B.subtilis C1R32，该菌株发酵上清液可显著抑制桑椹菌核病病原菌S.sclerotiorum PZ-2生长，破坏病原菌细胞结构。桑椹离体防效实验结果表明，B.subtilis C1R32能抑制S.sclerotiorum PZ-2扩散生长，延缓桑果发病，具有良好的生防潜力(表4)。B.subtilis C1R32抑菌机理初探结果表明，B.subtilis C1R32通过促进病原菌活性氧增加、产生氧化胁迫，损伤细胞壁，并影响病原菌糖代谢基因表达，通过减少病原菌糖原合成等途径来抑制S.sclerotiorum PZ-2生长(图7)。
图7 Bacillus subtilis C1R32对Sclerotinia sclerotiorum PZ-2基因相对表达情况的影响
众多研究表明，内生菌可以通过影响病原真菌细胞结构、代谢物合成及氧化应激来抑制病原真菌，从而达到防治植物真菌病害的目的。细胞壁是病原真菌的重要细胞结构，生防菌破坏病原菌细胞壁是防控病害的重要策略。Wang等分离到一株内生莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)BQ-33，该菌株对猕猴桃黑斑病菌(Didymella glomerata)有良好的拮抗作用，能破坏病原菌菌丝体细胞壁，使大量无机盐、蛋白质和核酸外渗。同样，本研究中B.subtilis C1R32处理S.sclerotiorum PZ-2后，病原菌纤维素酶相关基因上调表达，引起病原菌细胞壁破碎，导致细胞质大量流出。
氧化应激是指机体活性氧产生和清除失衡，造成活性氧积累，从而诱导细胞产生细胞毒素，进而对细胞结构和生物大分子造成损伤，诱导病原菌发生氧化应激，其也为生防菌防治植物病害的重要机制。Lu等报道了一株B.subtilis BS45的甲醇提取物会引起小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)菌丝活性氧水平增加，进而诱导菌丝细胞氧化应激相关基因表达水平增加。这与本研究中B.subtilis C1R32对S.sclerotiorum PZ-2的抑制结果相同，B.subtilis C1R32促进S.sclerotiorum PZ-2活性氧迸发，产生氧化胁迫，促进病原菌凋亡。Han等从棉花中分离筛选出一株对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)有拮抗效果的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)41B-1，发现其代谢产物伊枯草菌素(iturin)可通过诱导V.dahliae活性氧升高从而达到杀菌作用。
Su等报道侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)SN19-1无菌上清液处理水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)后，病原菌胞内活性氧水平显著增加，致病力减弱。同时，生防菌还可以通过影响病原微生物代谢达到防治病害的作用。Hu等通过转录组测序发现，B.amyloliquefaciens A-1能通过紊乱黄曲霉(Aspergillus flavus)NRRL 3357的淀粉和蔗糖代谢途径基因表达来拮抗黄曲霉，其在减少梨、花生和玉米腐败方面表现出显著的潜力。
张婷婷等报道，B.velezensis SX-45提取物可以显著减少人参根腐病原菌(Fusarium oxysporum)还原糖含量。本研究揭示了B.subtilis C1R32能够通过影响S.sclerotiorum PZ-2糖代谢相关基因表达，减少糖原积累，诱导S.sclerotiorum PZ-2氧化应激，以及损伤细胞结构等起到防治桑椹菌核病菌的作用，结果显示B.subtilis C1R32具有良好的生物防治潜能。后续研究将进一步鉴定B.subtilis C1R32菌株抑菌活性物质的主要成分，确定菌株的生物安全性及评估B.subtilis C1R32的田间防治效果的基础上，制备活菌制剂，将其应用于桑椹菌核病的生防实践。