摘要西瓜(Citrullus lanatus)是最受欢迎的水果之一，随着人们对生活品质的不断追求，提高产品质量已成为农作物高销量的关键因素。植物根际促生菌是一类能够促进植物吸收土壤中营养元素并提高植物健康的有益细菌。为了探究贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)菌株WB对西瓜植株的促生效应。本研究以菌株WB和西瓜种子为材料，使用功能性培养基解析菌株WB的促生能力，采用种子萌发实验以及盆栽实验验证菌株WB的促生效应并利用转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术阐释菌株WB的促生机制。结果表明，贝莱斯芽胞杆菌WB具有产生长素(indole-acetic acid,IAA)与纤维素酶的能力，还具有解磷、解钾和固氮的能力。种子萌发实验和盆栽实验的结果表明，菌株WB对西瓜植株的生长有促进作用。此外，菌株WB上调了与植物促生长相关的信号通路中基因的表达，包括：半萜和三萜类生物合成、苯丙烷类生物合成和植物激素信号转导途径；参与促进生长的转录因子，如MYB(myeloblastosis)、NAC(NAM,ATAF,CUC)和Dof(DNA binding with one finger)等也被诱导上调表达。综上，本研究发现了贝莱斯芽胞杆菌WB可以促进西瓜生长并对其促生机制进行了阐释，为其进一步应用提供了理论依据。
西瓜(Citrullus lanatus)是一种重要的经济作物，在数以万计的果蔬品类中深受大众喜爱。植物根际促生菌(plant growth promotingrhizobacteria,PGPR)是一类有益植物健康的细菌，其能促进植物的生长，可以改变土壤中矿质元素的形态使之有利于植物的吸收和利用，并能抑制植物病原体的活性。在过去的几十年里，微生物防治剂的应用已成为农作物管理的重要措施之一。
其不仅能改变微生物的群落结构，还能增强植物的免疫力，调控植物的生长发育，改善土壤环境。近年来，一些科研工作者不仅致力于发现新的微生物防治剂，还展开了大量有益微生物与植物相互作用的机制研究。PGPR可以通过多种机制增强植物生长力并缓解生物和非生物胁迫，如产生水解酶，分泌植物激素，解磷、解钾和固氮，以及诱导植物抗氧化酶活性，诱导抗性基因和转录因子的表达等。用内生芽胞杆菌(endophytic Bacillus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)预处理番茄(Solanum lycopersicum)植株，提高了其叶片中的生长素(indole-acetic acid,IAA)水平，有助于番茄植株对抗斜纹夜蛾(Spodoptera litura)并促进其生长。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtil⁃is)AH18和地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)K11能够调控纤维素酶基因(cellulase,cel)以抑制辣椒疫病病原菌辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的活性。此外，PGPR还可以产生不同的酶，例如，纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶，这些酶在维持土壤健康方面发挥了重要作用。
高地芽胞杆菌(B.altitudinis)MS16通过产生IAA、溶磷和分泌水解酶促进芥菜(Brassica juncea)植株的生长。固氮菌(Azospiril⁃lum lipoferum)菌株Az204和巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium var.phosphaticum)菌株PSB1显著提高了水稻(Oryza sativa)植株的生物量、发芽率和活力指数，提升了芽中的N、P和K含量。3种PGPRs：莫氏假单胞菌(Pseudomonasmosselii)S6、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)S7和芽胞杆菌(Bacillus sp.)JBS-28 S10通过产生IAA、氨基环氧丙烷酸脱氨酶(aminocylopropanecarboxylic acid,ACC)和苷酸，增加土壤中可利用的磷，促进了砷胁迫下水稻的生长。本课题组前期研究发现，贝莱斯芽胞杆菌(Ba⁃cillus velezensis)菌株WB能提高西瓜植株的免疫力，改变根际群落结构，产生淀粉酶、几丁质酶、铁载体和蛋白酶，能够引发氧化胁迫，抑制西瓜专化型尖胞镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,Fon)的生长。然而，目前还没有研究阐明菌株WB对西瓜植株的促生长机理。因此，本研究评估了贝莱斯芽胞杆菌菌株WB对西瓜种子萌发和幼苗生长的促生效应以及产生IAA、解磷、解钾和固氮的能力，利用转录组学探讨其促进西瓜生长的促生机制，为其在西瓜生产上的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1实验材料
西瓜(Citrullus lanatus)种子(益海星球)由黑龙江省齐齐哈尔市园艺研究所提供。贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)菌株WB(分离于西瓜根际)由齐齐哈尔大学生命科学与农林学院微生物生态学实验室提供。供试土壤的理化性质如下：pH 7.45、电导率0.639 ms/cm、有机质66.4 g/kg、有效磷13.0mg/kg、有效氮354.67 mg/kg。
1.2实验方法
1.2.1贝莱斯芽胞杆菌WB促生长能力的测定
1)分泌生长素能力的测定。将WB菌株接种于NB液体培养基中，置于摇床培养(30℃,120 r/min)24 h制作种子液，将1 mL的种子液接入含200 mg/L色氨酸的NB液体培养基中，在30℃、120 r/min条件下振荡培养60 h，每6 h测量1次IAA分泌量，IAA的生长曲线是y=0.002 4x-0.002 6，R2=0.999 1，采用分光光度法定量测定菌株的IAA产量
。
2)产纤维素酶能力的测定。将WB菌株接种于羧甲基纤维素钠培养基中，30℃下培养3 d，然后用1 g/L刚果红染色1 h，将染色液倒掉，之后用1 mol/L氯化钠溶液浸泡1 h，观察是否有透明圈。如果WB菌株产生纤维素酶，菌落周围会出现1个透明的圆圈。实验重复3次。
3)解磷、解钾和固氮能力的测定。将WB菌株接种在NB液体培养基中，并在30℃下培养24 h。
将活化的菌株分别接种到NBRIP固体培养基和亚历山大培养基中斑点培养5~7 d。观察该菌株周围是否有透明圈的形成，根据透明圈的有无判断菌株解磷和解钾的能力。将活化的WB菌株接入到90 mL阿须贝无氮培养基中，在30℃、120 r/min下分别培养2、4、6、8和10 d。提取其上清液，用总有机碳/总氮(TOC/TN)分析法测定总氮含量。
1.2.2种子发芽实验
用0.1%的升汞对西瓜种子表面消毒10 min，用无菌蒸馏水冲洗3次，30℃无菌催芽，待西瓜胚根长至0.5 cm时将西瓜种子转至湿热、灭菌且铺有2层滤纸的培养皿(直径=9 cm)中，每皿5粒种子。设置以下处理，WB处理：将3 mL不同浓度(4.0×106,4.8×107,5.6×108和6.4×109 CFU/mL)的WB菌悬液加入培养皿中；以加入相同体积的无菌水为对照(CK)。培养皿中的液体保持使种子保持湿润但不浸泡的状态，每个处理6个重复。西瓜种子置于温度为(28±2)℃，相对湿度为60%~70%，光暗周期为12 h/12 h的培养箱中培养，实验期间每3 d分别补充1次WB菌悬液和无菌水，14 d后测量西瓜种子的胚根长度。实验周期为15 d，1个周期浇灌5次。
1.2.3植物促生长实验
西瓜种子用0.1%升汞消毒10 min，无菌水清洗后在(28±2)℃下无菌催芽，待西瓜胚根长至0.5 cm时播种至装有灭菌土的营养钵(10×10×8cm3)中，每钵种1株。幼苗置于温度为(28±2)℃，相对湿度为60%~70%，光暗周期为12 h/12 h的培养箱中培养，当幼苗1片真叶时进行以下处理：西瓜苗用40 mL的贝莱斯芽胞杆菌菌株WB悬浮液(6.25×106 CFU/mL)浇灌，每3 d浇1次(WB处理)；使用相同体积的无菌水处理作为对照(CK)。每个处理包括3个平行，每个平行10个重复，培养西瓜植株30 d后取样，测量根长、株高、茎粗、根节数以及地上鲜重和地下干重。
1.2.4分子促生实验前处理
用0.1%的升汞对西瓜种子表面消毒10 min，无菌蒸馏水冲洗3次，30℃无菌催芽，待西瓜胚根长至0.5 cm时播于湿热灭菌的土壤中，每盆1株西瓜苗，待幼苗长至6~7片真叶时，接种40 mL贝莱斯芽胞杆菌菌株WB(6.25×106 CFU/mL)的菌悬液(WB处理)，以浇灌相同体积的无菌水为对照(CK)。
盆栽实验采用随机完全区组设计，每个处理有3个重复，每个重复30盆。在接种菌株WB后4和6 d时采集西瓜功能叶片并分别命名为WB4和WB6，每个重复收集5株相同部位的功能叶片并混合作为1个样品。将西瓜叶片立即用液氮冷冻并保存在-80℃冰箱中，用于转录组测序(RNA sequenc‐ing,RNA-seq)分析。
1.2.5总RNA提取和转录组分析
使用TRIzol®试剂盒(植物RNA纯化试剂盒,Invitrogen,美国)从样品中提取总RNA。使用2100生物分析仪(Agilent)和ND-2000(NanoDrop Tech‐nologies,美国)分光光度计测定RNA的质量和浓度。用高质量的RNA样品(OD260/OD280为1.8~2.2,RNA完整值(RNA integrity number,RIN)＞8)构建测序文库。用Illumina(美国)的TruSeqTM RNA样品制备试剂盒构建RNA-seq文库。在Illumina2230HiSeq xten/NovaSeq 6000测序仪上进行测序(2×150 bp读数长度)。
使用SeqPrep修剪原始数据，并使用Sickle软件对默认参数进行质量控制。西瓜栽培品种'97103'(Citrullus lanatus subsp.vulgaris)的基因组作为参考基因组。使用HISAT2软件，在定向模式下将经过滤处理后的有效片段数目分别与参考基因组进行比对。使用DESeq2、DEGseq和EdgeR对差异表达基因(differential gene expression,DEGs)进行筛选。显著差异表达的标准是差异倍数(fold change,FC)≥2或≤0.5和P-adjust＜0.05。使用基因本体论(GeneOntology,GO)和KEGG进行注释，并进一步分析DEGs和通路表达量变化的原因。
转录因子(transcription factor,TF)使用植物TF数据库(http://planttfdb.gao-lab.org/)进行鉴定。
1.2.6 qRT-PCR验证
为了验证RNA-seq的结果，从RNA-seq分析中选择了4个DEGs，并进行qRT-PCR分析以验证其表达变化。使用Revert Aid Premium逆转录酶(Thermo Scientific,美国)将纯化的RNA逆转录成cDNA。qRT-PCR分析在LightCycler 480实时PCR仪器(Rotkreuz,瑞士)上进行。qRT-PCR反应体系(10µL)：5µL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，正、反向引物(10µmol/L)各0.2µL，1µL模板(cDNA)和3.6µL ddH2O。使用Primer Premier 5软件设计用于qRT-PCR的引物(表1)，由上海美吉生物医药科技有限公司合成；18S rRNA基因作为内参基因。
qRT-PCR反应条件：95℃预变形3 min；95℃变性15 s，60℃30 s，45个循环；72℃1 min。使用2-ΔΔCt方法进行基因相对定量分析。每个测量重复3次。
1.2.7数据分析
使用SPSS 25.0软件的Tukey's HSD检验在P＜0.05水平上进行差异显著性分析。所有数据均以3个生物学重复的平均值±标准误差表示。