近日，浙江大学生命科学研究院蒋超课题组联合北京大学第三医院冷玉鑫课题组和中南大学湘雅二医院罗红课题组，在Nature Communications杂志在线发表题为"Deep longitudinal lower respiratory tract microbiome profiling reveals genome-resolved functional and evolutionary dynamics in critical illness"的研究论文。该研究利用新型开发的低生物量微生物富集方法（Chelex100-based low-biomass microbial-enrichment method，CMEM），在基因组水平首次系统揭示了重症监护病房（ICU）患者下呼吸道微生物组的功能和进化动态，为重症感染的精准诊断和个性化治疗提供了新思路。
摘要
下呼吸道感染（LRTIs）是全球性的主要健康问题，2019年已致约300万人死亡。在重症监护室（ICU）中，患者感染医院获得性下呼吸道感染的风险和病死率均显著增加。研究显示，健康人与患者的下呼吸道微生物群落存在显著差异，提示微生物组在免疫稳态中的关键作用，且可能是新的治疗目标。然而，目前对其认识十分有限。在进行相关研究时，实验过程中面临诸多的挑战，例如高丰度的宿主DNA污染问题、微生物生物量相对较低的情况，以及连续收集下呼吸道样本所面临的困难。
为此，研究团队开发了一种基于Chelex-100的微生物富集方法（CMEM），有效去除宿主DNA并提高微生物DNA产出，使得能直接从临床下呼吸道样本构建微生物基因组，进行全基因组水平的系统分析。通过CMEM技术，研究团队处理了来自中国三家医院的157名ICU患者的453个下呼吸道样本，重构了120个高质量的宏基因组及其质粒序列。该研究揭示了肺炎患者下呼吸道微生物群落的物种级别特征和抗性基因，并发现了是否确诊肺炎、ICU住院时间与特定抗性基因丰度的增加相关。此外，研究团队还观察到机会致病菌的抗性和毒力基因组的菌株特异性，以及质粒的保守进化。综上，该研究结果不仅提供了医院内菌株传播的新视角，还展示了CMEM方法在ICU患者下呼吸道微生物监测和研究中的应用潜力。
关键点
CMEM方法的开发：结合基于皂苷的宿主DNA去除技术以及Chelex 100的应用，实现重症病房患者下呼吸道微生物组的深度测序和菌株水平分析。
重症监护病房特异性微生物特征：揭示了不同ICU内患者特有的微生物组成，以及不同医院的ICU之间在主要机会致病菌和抗生素抗性基因上的显著差异。
临床数据整合分析：结合临床数据揭示了不同的下呼吸道微生物组的动态变化模式可能与患者更严重的肺功能障碍和更强的炎症反应密切相关。
菌株水平全景分析：基于菌株水平的分析描绘了重症监护病房患者下呼吸道微生物群落的基因组功能、传播及进化特征的全景图。
引言
下呼吸道感染是全球公共卫生领域面临的主要挑战之一。2019年，因下呼吸道感染导致的死亡人数高达300万，使其成为全球致死率最高的传染病。ICU患者罹患医院获得性下呼吸道感染的风险比普通人群高出3到10倍，并且与之相关的病死率显著升高。研究表明，ICU患者的下呼吸道微生物群落与健康个体存在显著差异，提示下呼吸道微生物组在维持机体免疫稳态中发挥着重要作用，并有望成为新的治疗靶点。然而，目前对ICU患者下呼吸道微生物组的理解仍然有限，关于其纵向动态变化、与宿主相互作用以及病原菌在临床环境中进化适应的研究十分有限。
实验方法上面临诸多挑战，包括口腔共生菌和宿主DNA污染、微生物生物量低，以及纵向样本采集困难等问题。大多数研究采用16S rRNA等扩增子测序技术，但这种方法存在明显的PCR偏好性、难以实现全面物种鉴定及功能和进化分析等方面的局限。此外，由于痰液易受口腔菌群污染而支气管肺泡灌洗液（BALF）取样具有创伤性，使得获取连续时间点的高质量样本变得十分困难。
传统上，人们主要依赖微生物培养的方法来诊断下呼吸道微生物、获取全基因组信息及进行功能表征。但是，微生物培养方法不仅需要了解特定菌种的生长条件，而且工作量大，因此能够被深入研究的菌种数量非常有限。相比之下，宏基因组学方法能够在测序深度足够的情况下生成近似不同物种基因组信息的高质量宏基因组装基因组（MAGs），从而克服了上述限制。尽管如此，基于MAGs开展的下呼吸道微生物研究仍相对匮乏。
研究团队应用CMEM方法处理了来自中国三家医院的157名重症监护病房患者的453个纵向下呼吸道抽出物样本。通过高通量测序和后续的宏基因组组装，我们无需传统的微生物培养技术，便成功重构了120个高质量的宏基因组组装基因组及其相关的质粒序列。借助对下呼吸道样本进行深度测序的数据，研究团队成功地对ICU患者下呼吸道中的微生物群落进行了全面的物种级别分析。该研究在肺炎患者群体中揭示了显著的医院特异性机会致病菌物种特征和抗性基因特征；通过纵向动态采样，进一步观察到肺炎患者下呼吸道内机会致病菌物种特征随时间发生分化的现象。经过深入探究，研究团队发现是否确诊肺炎以及患者在重症监护病房的停留时长，均与某些特定的抗生素耐药基因的丰度具有显著的相关性。
研究团队基于MAGs的分析揭示了机会致病菌中不同菌株之间存在菌株特异性的抗性基因组和毒力基因组；并通过进化分析观察到，在广泛流行的机会致病菌中，可移动基因元件的数量显著增加，同时部分质粒在数十年的进化过程中显示出高度的保守性。此外，研究团队还成功鉴定了鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌中的新型重组热点区域，并发现位于这些重组热点区域的基因功能与接合元件（conjugative elements）和前噬菌（prophages）有密切关联。最终，结合流行病学数据和微生物培养数据的综合分析，研究团队揭示了重症监护室内患者间菌株传播现象的频繁发生，为深入理解和阐释医院内病原菌感染的传播机制提供了新的视角。
结果
CMEM的开发及其在下呼吸道微生物组深度测序中的应用
研究团队开发了一种名为CMEM的方法，该方法能够显著提高去除宿主DNA后的微生物DNA产量（图1a）。这一改进极大地提升了可检测到的微生物DNA产率。简而言之，该研究采用了一种改良的皂苷基差分裂解法来去除人源DNA，并通过降低皂苷浓度优化了此过程以减少对微生物群落可能造成的损失。为应对下呼吸道样本中低微生物生物量带来的挑战，研究团队在处理过程中加入了超声破碎步骤以促进微生物细胞裂解。随后，利用常用于法医调查中的Chelex 100提取极少量的微生物DNA，最终得到适用于深度宏基因组测序的高质量DNA（图1a）。与Qiagen Power Water及Qiagen Allprep DNA/RNA试剂盒进行的直接对比显示，CMEM产生的最终DNA产量明显更高，并且显著增加了可检测到的DNA回收率。由于CMEM在DNA产出方面的高效率，对于下呼吸道样本构建测序文库时平均仅需5轮扩增循环，这大大减少了先前研究中处理低生物量样本时PCR扩增引入的偏差。此外，整个CMEM流程在一个单管内完成，简化操作的同时也最大限度地减少了DNA损失以及转移过程中潜在污染的风险。