枝孢菌（Cladosporium link）是广泛存在于自然界的一类真菌，可侵染植物叶片和根茎，造成果蔬及粮食作物产量降低，品质下降。同时，枝孢菌也是苹果、生菜、猕猴桃、草莓等果蔬采后腐烂的主要致病菌，造成严重的经济损失。此外，枝孢霉还对人体健康产生威胁。
针对真菌病害控制，国内外学者做了大量研究，如通过复配精油、臭氧、气调、化学杀菌剂、拮抗菌、植物提取液、温湿度调节等手段来抑制真菌的活性和繁殖能力，降低真菌病害的发生。气调是当今果蔬保鲜中较为有效的方法之一，其通过改变贮藏环境内气体比例并结合温、湿度，来降低果蔬营养物质消耗并抑制病原菌，以延长果蔬保鲜期，具有无毒、高效、天然的特点。
目前气调保鲜多采用低O2、高CO2的气体配比，虽然能在一定程度上抑制果蔬生理生化活动，减少能量消耗，但易出现异味，CO2伤害等现象。本课题组前期研究表明，高O2配合高CO2保鲜有很好的协同作用，一方面通过高CO2降低果蔬的呼吸速率以延长果蔬贮藏期，另一方面通过高O2来缓解果蔬受到高CO2的伤害，提高果蔬的贮藏品质，目前已成功应用于西兰花和生姜的采后贮藏，取得了较好的保鲜效果。然而，针对O2/CO2主动自发气调的抑菌效果尚未深入研究。
为此，本试验采用O2/CO2主动自发气调处理枝孢菌，通过定期测定枝孢菌的生长情况、菌株细胞膜透性、活性氧防御酶及细胞壁降解酶活性等指标，探讨O2/CO2主动自发气调的抑菌效果，为其在果蔬采后枝孢菌及其它微生物病害的防治方面提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
供试菌从贮藏期内发病的猕猴桃上分离、纯化，经山东泓迅生物科技有限公司鉴定，Blast比对分析，确定为枝孢菌菌株（Cladosporium link）。
琼脂、磷酸氢二钠、羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钠、果胶，天津市光复精细化工有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸（DNS）、乙二胺四乙酸（EDTA），天津市化学试剂研究所；乙酸、柠檬酸、无水乙醇、过氧化氢、愈创木酚、乙酸钠、柠檬酸钠，烟台市双双化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、浓盐酸、亚硫酸钠，天津市凯通化学试剂有限公司；苯酚、氢氧化钠、酒石酸钾钠，莱阳市康德化工有限公司。所用试剂均为分析纯级。
1.2仪器与设备
GXZ-260B光照生化培养箱，宁波江南仪器厂；UV-1750紫外可见分光光度计，岛津国际贸易有限公司；MR-07825-00 O2/CO2测定仪，美国FBI Dansensor公司；XW-80A涡旋混合器，上海青浦沪西仪器厂；DDS-307A电导率仪，上海精科雷磁仪器；XS-212-20光学显微镜，苏州胜视电子设备有限公司；S-50HD立式自动电热压力灭菌锅，济南来宝医疗器械有限公司；GL-20G-2台式高速冷冻离心机，上海安亭仪器制造厂；RDL380P气调包装机，罗迪博尔机械设备有限公司。
1.3试验设计
将经3次活化后的枝孢菌扩大培养后，制取浓度为106CFU/mL的孢子悬浮液，以5μL的接种量接种于培养皿中心（直径9 cm），晾干后装入气调袋。然后向气调袋内分别充入体积为5 L的60%O2+40%CO2、70%O2+30%CO2、80%O2+20%CO2、90%O2+10%CO2和自然空气（ck），置于生化培养箱（28±0.5）℃培养，每隔2 d测定相关指标。每个处理设置10个气调袋，每个气调袋内放置4个培养皿。
1.4指标测定
1.4.1菌落形态观察及直径测定在培养皿内直接观察菌落形态，并使用十字交叉法测量菌落直径，重复3次。
1.4.2微观结构观察在菌落边缘挑取菌丝固定在载玻片中央，然后直接在400×光学显微镜下观察并拍照。
1.4.3孢子量的测定在菌落边缘用打孔器（直径6 mm）随机取3个菌碟，置于已加入15 mL蒸馏水的离心管中，涡旋混合器振荡10 min，然后使用2层纱布过滤并冲洗2次，显微镜下计数，并计算整个菌落面积的孢子总数。
1.4.4菌株细胞内容物释放量的测定用打孔器在菌落边缘随机打3个菌碟，置于0.05 mol/L，pH 7.2的磷酸钠缓冲液中，超声波破壁15 min后，4 000 r/min离心10 min，上清液在波长260 nm下测定吸光值。
1.4.5菌细胞电导率的测定上清液的获取同1.4.4节的方法，使用电导率仪直接测定电导率。
1.4.6处理后枝孢霉后续生长曲线的测定取2 mL气调处理8 d的枝孢菌孢子悬浮液（制取步骤同1.4.3节的方法）与18 mL PDB培养液混合，于28℃，200 r/min摇床培养，每隔4 h或6 h取样，抽滤后在60℃下将菌丝体烘干并称重。
1.4.7超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定孢子悬浮液的制取同1.4.3节的方法（预冷的0.2 mol/L，pH 7.8的磷酸钠缓冲液代替蒸馏水），并将孢子浓度稀释至106CFU/mL，然后吸取8 mL菌液于10 mL离心管，冰浴超声波破壁15 min后，4℃，12 000 r/min离心20 min，取上清液作为粗酶液。通过邻苯三酚自氧化法测定SOD活性，25℃下降低邻苯三酚自氧化速率50%所需要的量为1个酶活力单位（U）。
1.4.8过氧化氢酶（CAT）活性的测定粗酶液的制取同1.4.7节的方法（缓冲液使用0.2 mol/L，pH 7.0的磷酸钠）。采用过氧化氢分解法测定CAT活性，将吸光值每秒钟改变0.001定义为1个酶活力单位（U）。
1.4.9多聚半乳糖醛酸酶（PG）和多聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性的测定取8 mL浓度为106CFU/mL的孢子悬浮液（制取步骤同1.4.3节的方法），超声波冰浴破壁15 min后，4℃，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。PMG和PG活性的测定分别用果胶酸钠和果胶作为底物，采用DNS显色法在波长540 nm处测定吸光度。将50℃下每分钟内每毫升酶液分解底物时释放1μg还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位（U）。
1.5数据处理
所得数据使用SPSS 19.0软件进行LSD显著性分析及相关性分析（P＜0.05），并用Excel软件作图。
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