人们曾经认为D－氨基酸在生物进程中发挥着相对较少的作用，并称之为“非天然氨基酸”。然而近期的研究表明，D－氨基酸在细胞结构及信号调控中发挥着重要的作用，科学家们认为阐明D－氨基酸如何调控细胞壁重塑及生物被膜降解的机制不仅能够对细胞质外的进程有一个新的理解，并且能够促进新疗法的发展［1］。随着研究的不断深入，D－氨基酸在医药、农业和食品等领域的用途被迅速发掘，如D－氨基酸及其衍生物作为重要的手性原材料被广泛地应用于半合成抗生素、多肽激素、杀虫剂和甜味剂等的合成中。
目前，随着应用的推广，D－氨基酸的工业需求量也逐渐增大。D－氨基酸制备方法主要有：对映体拆分法、化学合成法和生物法。酶法合成作为生物法中应用最多的方法，具有无污染、反应条件温和、操作简便、成本低、产物纯度高等优点，展现出很好的商业前景［6］。在酶法合成D－氨基酸的过程中，D－氨基酰化酶是主要使用的几种酶之一。迄今已发现的产D－氨基酰化酶的微生物包括产碱菌属、假单胞菌属、贪噬菌属、狭长平胞属、拟无枝酸菌属、博德特菌属、葡萄糖菌属、甲基杆菌属、类诺卡氏菌属、微杆菌属、链霉菌属和木霉属等［7］。其中，来自产碱菌属的D－氨基酰化酶已经应用于工业化生产［8］。然而，国内对D－氨基酰化酶的研究还处于基础阶段，商品酶仍需进口。
土壤筛选是获得产酶微生物的重要途径。作者从氨基酸类化工厂附近土样中筛选产D－氨基酰化酶的菌株，并对活性较高的菌株进行了鉴定及培养条件的初步优化。
1实验
1.1材料与试剂
土样采自江苏省某氨基酸类化工厂排污区附近。
细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒，上海生工生物工程有限公司；250bp DNA Ladder Marker，宝生物工程（大连）有限公司；Taq DNA聚合酶，北京康为世纪有限公司；DNA引物（PAEG纯），上海捷瑞公司；其它化学试剂均为分析纯或色谱纯。
1.2培养基
分离培养基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂2%，蒸馏水配制，调节pH值至7.0。
发酵培养基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸膏2%，蒸馏水配制，调节pH值至7.0。
1.3方法
1.3.1菌株的分离
采用平板稀释法从土样中分离菌株。取土壤样品5g，用无菌生理盐水逐级稀释至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5数量级，各取0.2mL均匀涂布于分离平板上，每个稀释度涂3个平板，30℃倒置培养48h。观察并挑选生长快速、菌落较大的菌株划线纯化，纯化的菌株斜面置于4℃冰箱保存［9］。
1.3.2菌株的筛选
1.3.2.1初筛
将纯化的菌株转接到发酵培养基中，于30℃、200 r·min－1摇瓶培养48h。低温离心收集菌体，菌体用适当比例的50mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液（pH值7.8）充分悬浮，加入适量200mmol·L－1的底物N－乙酰－D－甲硫氨酸至浓度为20mmol·L－1，混合均匀，于37℃恒温水浴振荡1h，之后立即沸水浴10min终止反应。离心后取上清液1μL点样进行蛋氨酸的硅胶薄层层析，展开剂为V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）＝4∶1∶1。每次需展开剂25mL，另加入1mL 0.5%茚三酮溶液，混合均匀，展开结束后，电吹风热风吹干；显色斑点与0.05mmol·L－1蛋氨酸的标样斑点比较，检测蛋氨酸的含量以反映D－氨基酰化酶的活力。为了消除所用试剂和菌体本身所含氨基酸对测定的干扰，将悬浮后的菌体先煮沸10min，然后加入底物，其余操作同上，作为空白对照。保留蛋氨酸斑点较大且无杂斑点的菌株进行复筛［10］。
1.3.2.2复筛
将初筛保留的菌株转接到发酵培养基中，于30℃、200r·min－1摇瓶培养48h；采用茚三酮比色法测定酶活［10］，方法同1.3.2.1。
酶活力单位（U）定义：在pH值7.8、37℃条件下，1min内酶催化底物水解释放出1μmol D－甲硫氨酸为1U。
1.3.3菌株A55的鉴定
1.3.3.1形态学特征观察及生理生化特征测定
依据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）［11］和《常见细菌系统鉴定手册》［12］进行试验，鉴定菌种。
1.3.3.2菌株A55的16SrDNA序列测定及系统发育分析
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株A55的基因组DNA。以基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增。PCR扩增参数：94℃预变性4min；94℃解链40s，55℃退火40s，72℃延长1.5min，30个循环；最后72℃延长10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测，纯化后交南京思普金公司测序。将测序得到的16SrDNA序列通过Blast与GenBank中细菌及古菌的16SrDNA序列进行比对，利用Mega5.2软件进行系统发育分析。采用邻接法（neighbor－joining method）构建系统发育树，并对所构建的系统发育树进行自举分析（bootstrap method，1 000次重复），估算其内分支的支持率［13］。
1.3.4影响D－氨基酰化酶合成的因素考察
以发酵培养基为基础培养基，考察培养温度、培养基初始pH值、摇床转速、摇瓶装样量、菌龄、碳源、氮源等对菌体生长及酶活力的影响，优化菌株A55的培养条件［14］。