摘要:【背景】西藏扎布耶盐碱湖水体富含高浓度CO32−、HCO3−和Na+，可能栖息具有潜在应用价值的盐单胞菌(Halomonas sp.)菌株。【目的】筛选积聚相容溶质四氢嘧啶的盐单胞菌菌株，并分析四氢嘧啶积聚的影响因素和最优发酵条件。【方法】采用Horikoshi-Ⅰ培养基分离扎布耶盐碱湖水样中嗜碱盐且能高效积聚四氢嘧啶的盐单胞菌株，并明确生理生化特性和分类学地位。基于单因素条件、Plackett-Burman、Box-Behnken试验和HPLC检测，分析菌株胞内四氢嘧啶积聚量的关键影响因素并优化其发酵条件。【结果】筛选获得扎布耶盐碱湖盐单胞菌共计10株(分属5个种)，优势种是嗜碱盐单胞菌(H.alkaliphila，4株，占40%)。H.alkaliphila ZB109的最佳生长盐度范围为0.5−2.5 mol/L，最适生长pH值8.0−10.0，四氢嘧啶的初始积聚量为303.62 mg/L。菌株ZB109的菌落圆形，边缘光滑，呈黄色，革兰氏染色阴性，显微形态呈短杆状、周身纤毛。NaCl、Mg2+和底物L-谷氨酸钠浓度是菌株ZB109积聚四氢嘧啶的关键影响因素。采用响应面法优化培养条件，菌株ZB109单批次摇瓶发酵48 h的四氢嘧啶积聚量可达696.313 mg/L。【结论】菌株ZB109兼具耐盐和耐碱的生长特性，相较于其他分离盐单胞菌分离株，四氢嘧啶的积聚潜力更大，可为后续四氢嘧啶的大规模发酵生产提供良好的菌种种质资源。
盐单胞菌属(Halomonas)分类隶属于γ-变形杆菌纲(Gammaproteobacteria)海洋螺菌目(Oceanospirillales)盐单胞菌科(Halomonadaceae)，是一类耐盐、好氧的革兰氏阴性细菌，大多数呈杆状，耐盐生长范围较为宽泛。截至2023年12月，模式微生物基因组数据库(List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature,LPSN,https://lpsn.dsmz.de/genus/halomonas)共计收录盐单胞菌属菌株172个种，典型代表如延长盐单胞菌(H.elongata)、樊氏盐单胞菌(H.ventosae)、蓝晶盐单胞菌(H.bluephagnesis)和坎帕尼亚盐单胞菌(H.campaniensis)等。盐单胞菌是发酵生产生物塑料聚β-羟基丁酸(poly-β-hydroxybutyric acid,PHB)和相容溶质(四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶)的典型模式菌株。盐单胞菌广泛分布于海洋、盐湖、盐碱湖、盐碱地沙漠等特殊生境。Zhang等曾从小柴旦盐湖分离获得盐单胞菌(Halomonas sp.)XH26，四氢嘧啶(ectoine)的积聚量达到456.82 mg/L；朱德锐等从青海湖分离获得樊氏盐单胞菌(H.ventosae)QHL5，ectoine积聚量为379.6 mg/L；Quillaguamán等从盐碱湖Laguna Colorada中分离获得玻利维亚盐单胞菌(H.boliviensis)LC1，ectoine积聚量可达740 mg/L。
盐碱湖为一类具有高矿化度和高碱性水化学特征的湖泊，生境中常栖息耐盐、耐碱或兼性耐盐碱的野生型盐单胞菌株，是盐单胞菌的主要分离来源地。Zhang等从乌鲁木齐盐碱湖(矿化度89.32 g/L，pH 8.3)分离获得一株耐盐碱的盐单胞菌新种H.urumqiensis BZ-SZ-XJ27；Romano等从盐碱湖Campania Region(矿化度58.5 g/L，pH 8.5)分离获得一株耐盐碱的盐单胞菌新种H.campaniensis 5AG；Poli等从南极盐碱湖Cape Russell(矿化度156.8 g/L，pH 9.0)分离获得一株嗜盐、嗜冷和耐碱的盐单胞菌新种H.alkaliantarctica CRSS。扎布耶盐碱湖(E83°57′−84°15′，N31°27′−31°34′)位于西藏日喀则地区，矿化度243−396 g/L，pH 9.0−9.5，水体富集扎布耶石、钾芒硝、氯碳钠镁石和天然碱等，属于典型的碳酸盐型盐湖。陶宇杰等利用Illumina高通量测序分析扎布耶盐碱湖(南湖)的细菌多样性，发现盐单胞菌具有较高的物种丰度(0.54%−8.75%)。若采用纯培养分离可能获得具有潜在应用价值的盐单胞菌。基于此，本研究以扎布耶盐碱湖水样为研究对象，分离筛选盐单胞菌菌种资源，分析菌株生理生化与生长特性、胞内ectoine积聚量；基于单因素试验与响应面法优化ectoine的发酵条件，提高ectoine的积聚量，为后续菌株的基因改造和代谢工程菌株研究提供良好的菌种资源。
1、材料与方法
1.1样品
2019年7月中旬采集扎布耶盐碱湖的水泥混合物样本，样本置于4℃车载冰箱载回。
1.2主要试剂和仪器
NaCl和L-谷氨酸钠(L-monosodium glutamate monohydrate,MSG)等分析纯；细菌全基因提取试剂盒；细菌生化鉴定试剂盒；2×PCR Mix；Taq DNA聚合酶；Ectoine标准品。PCR仪；HPLC；扫描电子显微镜；光学显微镜。
1.3培养基及纯培养菌株的分离
Horikoshi-Ⅰ分离培养基(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母粉5.0，K2HPO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.2。Ectoine发酵培养基(g/L)：KCl 55.9，MgSO4·7H2O 24.7，MSG 6.5，柠檬酸钠3.0，酶水解酪素7.5，无水CaCl2 0.2，酵母浸出物2.0，115℃灭菌15 min。使用NaCl溶液(6 mol/L)配制盐梯度，用Na2CO3溶液(1 mol/L)调节pH值，固体培养基添加16 g/L琼脂粉。扎布耶盐碱湖水样(50μL)直接涂布Horikoshi-Ⅰ固体培养基(盐梯度组：0.0−3.0 mol/L，间隔0.5；pH梯度组：8.0−13.0，间隔1.0)，10−15平板/梯度组，37℃恒温箱培养72 h。挑取不同形态的菌落进行活化(Horikoshi-Ⅰ培养基、37℃、180 r/min振荡培养24 h)，划线纯化菌株3−4次。
1.4菌株生长特性与胞内ectoine积聚量分析
将1.3分离获得的待测菌株接种于Horikoshi-Ⅰ培养基37℃、180 r/min振荡培养24 h进行活化。设置不同NaCl浓度梯度组(0.0−3.0 mol/L，间隔0.5)和pH梯度组(8.0−13.0，间隔1.0)的Horikoshi-Ⅰ培养基(n=3/组)，活化菌液接种量1.0%，37℃、180 r/min振荡培养48 h，检测光密度值OD600。嗜碱盐细菌分类：提取纯培养菌株胞内ectoine并进行HPLC检测。流动相：乙腈:水为80:20；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：210 nm；进样量：15μL。
1.5形态学与生理生化鉴定
采用Horikoshi-Ⅰ培养基活化纯化菌株，37℃、180 r/min振荡培养12 h；采用Horikoshi-Ⅰ固体培养基进行平板划线，观察菌落形态。采用革兰氏染色法对菌体染色，使用油镜观察菌体形态(1 000×)；采用戊二醛锇酸双重固定法固定菌体，使用扫描电子显微镜观察菌体细胞显微形态(8 000×)。参考细菌生化鉴定试剂盒说明书进行碳氮源利用试验和生理生化鉴定。
1.6分子生物学鉴定与系统发育树的构建
采用Horikoshi-Ⅰ培养基活化菌株，37℃、180 r/min振荡培养12 h，采用细菌全基因提取试剂盒提取基因组DNA并进行16S rRNA基因PCR扩增。引物为27F(5′-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGTTACCTTG TTACGAC-3′)。PCR反应体系(30μL)：2×PCR Mix 15μL，DNA模板(10−20 ng/µL)1μL，上、下游引物(10µmol/L)各2μL，ddH2O 10μL。PCR反应条件：95℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，33个循环；72℃5 min。PCR纯化产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。使用Lasergene v7.1软件包对测序结果进行拼接整理，通过NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析已拼接的序列，明确分离菌株的分类学地位。利用MEGA v11.0软件构建系统发育树，采用Neighbor-joining法，bootstrap为1 000。
1.7单因素试验与发酵条件优化
选择ectoine发酵培养基设置6个单因素分组试验，即NaCl浓度梯组(0.0−3.0 mol/L，间隔0.5)、Mg2+浓度梯度组(0.05−0.25 mol/L，间隔0.05)、Ca2+浓度梯度组(2.0−10.0µmol/L，间隔2.0)、MSG浓度梯度组(0.02−0.10 mol/L，间隔0.02)、CaCO3梯度组(5.0−25.0 g/L，间隔5.0)和pH梯度组(7.0−11.0，间隔1.0)。分批次检测待测菌株胞内的ectoine积聚量(180 r/min，48 h，n=3)，取平均值绘制曲线图。基于单因素结果，使用Design-Expert v11.0软件进行Plackett-Burman和Box-Behnken多因素试验设计。通过Plackett-Burman设计确定关键变量(表1)，以NaCl浓度(X1)、Mg2+浓度(X2)、Ca2+浓度(X3)、MSG浓度(X4)、CaCO3浓度(X5)作为实验因素，以ectoine积聚量为响应值。结合Plackett-Burman结果采用Box-Behnken法设计三因素三水平的响应面优化方案(表1)，以ectoine积聚量为响应值，优化菌株培养基组成比例并验证。
表1试验因素与水平
1.8数据处理
建立ectoine检测标准曲线：Y=(X−9.819 5)/249 12，R2=0.99，式中Y为ectoine积聚量(g/L)，X为HPLC峰面积。采用SPSS v26.0软件进行统计分析。
嗜碱盐单胞菌菌株生理生化与生长特性、最优发酵条件——摘要、材料与方法
嗜碱盐单胞菌菌株生理生化与生长特性、最优发酵条件——结果与分析
嗜碱盐单胞菌菌株生理生化与生长特性、最优发酵条件——讨论、结论