3、讨论


在利用重组大肠杆菌进行高密度发酵的过程中,发酵液中会有代谢副产物乙酸的积累,乙酸的存在抑制工程菌的生长及外源基因的表达。乙酸对重组大肠杆菌的抑制作用已有报道,本研究根据实验中出现的这一现象,进行了更加深入的理论基础研究,对乙酸的抑制作用机理进行了探讨。


研究中发现,在加入乙酸钠的环境中,菌体会出现一定的适应期,较低浓度(0.5、1和2 g/L)的乙酸钠对菌体影响较小,并且可能是由于质子化的乙酸根进入细胞后,可以作为碳源参与到细胞内的代谢中,供菌体生长所用,所以会对菌体生长稍有促进;而在较高乙酸钠浓度下,菌体细胞或其代谢过程可能会被破坏,因而菌体生长受到严重抑制。本研究首先研究了乙酸、乙酸钠对重组大肠杆菌细胞形态及显微特征的影响,发现菌体会发生皱缩或者凹陷,有些菌体周围可以看出类似发生了内容物的外泄,这可能是由于乙酸、乙酸钠引起了菌体细胞膜的破坏,进而导致了菌体形态的变化甚至内容物的外泄。


根据上述现象,通过实验进一步研究了乙酸、乙酸钠对于菌体细胞膜的影响,细菌的细胞膜具有一定的流动性,当细菌细胞膜遭到破坏,使得其半透性及流动性降低时,细胞的内环境稳定性会被破坏,从而导致内部的电解质(如K+)外渗,培养液的电导率上升。细菌细胞膜是细菌的结构组分,不仅是细胞的保护屏障,也是在细胞的生命活动中有着复杂功能的重要结构。当细胞膜遭到破坏时,首先细胞内的小分子物质外渗出来,然后是DNA和RNA等一些大分子的外渗,而DNA和RNA在260 nm处有强吸收,因此,对260 nm吸收物质的检测被广泛应用于测定细胞膜的完整性。测定处理后菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化,通过测定处理后菌液上清在260 nm处的吸光度值变化推测菌体细胞膜的完整性变化,而这两个实验结果比较复杂,分析可能涉及到乙酸、乙酸钠的解离和水解问题,但结果说明菌体细胞膜的通透性与完整性都会受到一定的影响。


细菌在受到乳糖诱导后均可产生β-半乳糖苷酶,β-半乳糖苷酶是位于细胞内的水解酶,能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)是乳糖的类似物,β-半乳糖苷酶可以将ONPG水解成半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚,因此可以通过颜色的变化测知β-半乳糖苷酶的活性。实验通过测定菌液上清中的β-半乳糖苷酶的活性,来检测胞内大分子渗透至胞外的情况,进而说明细胞内膜的受损情况,不同浓度的乙酸钠对其作用后会有影响,但差别较小。


蛋白质分子中因含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等氨基酸残基而产生内源性荧光。在大多数情况下,可以认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基,其变化直接反映了蛋白质中色氨酸残基本身及其周围环境的变化。当某些小分子如药物等物质与蛋白质结合时,导致其荧光强度下降,称为荧光淬灭作用。根据Trp的激发波长Ex,固定Ex,通过日立F-4500荧光分光光度计在310-450 nm范围内扫描即可确定Trp在重组大肠杆菌膜蛋白中的发射波长Em。


为了确定Trp在重组大肠杆菌膜中的位置,需要将猝灭剂KI(1 mol/L)稀释成不同浓度(0、0.01、0.02、0.05和0.1 mol/L)加入,检测对Trp发射波长Em的峰位和峰高的影响。如果Em迅速降低,则表明该氨基酸残基位于表面,如果Em变化不大,则表明该氨基酸残基位于膜内,如果Em逐渐降低,就表明该氨基酸残基的位置有两种可能,可能是在膜内也有可能是在膜外。结果表明乙酸能够改变细胞膜的结构,使位于细胞膜内的Trp残基暴露于细胞膜外。这个结论比较明确地说明了乙酸会对细胞膜产生影响,进而影响其功能。


在研究乙酸钠对蛋白合成的影响时,可以看到明显的趋势,低浓度下乙酸钠的添加会促进海藻糖合酶的表达量,而高浓度的乙酸钠又会起到抑制作用。其原因可能是乙酸根会影响DNA的复制或表达,也可能是乙酸钠使菌体细胞膜受到损坏,导致一部分酶发生了外泄造成的。


在研究过程中,采用的是菌液中外源添加乙酸、乙酸钠的方法,由于乙酸在溶液中的存在形式有乙酸分子形式及乙酸根形式,则试验中分别对两种形式进行了研究,添加乙酸、乙酸钠至所需的浓度后,菌液的pH变化与对照组相差较小,因此主要考虑了乙酸、乙酸根的影响。


据已有的研究表明,某些抑菌剂可与细菌染色体DNA发生相互作用,导致DNA的复制、转录以及表达受到抑制。本试验中乙酸会影响海藻糖合酶的表达量,这可能是由于乙酸对胞内DNA、RNA等产生抑制作用直接影响其表达量,也可能是由于随着乙酸浓度的增大,重组菌细胞的通透性、结构等发生变化,导致部分蛋白发生泄露,因而影响了目的蛋白的含量。具体的机制还需要今后做进一步研究,进行验证。


4、结论


根据发酵过程中的检测初步研究了乙酸(钠)对重组大肠杆菌的抑制作用及部分作用机理。通过外源添加乙酸(钠)的方法,对重组菌的生长曲线、细胞膜通透性、细胞膜结构、细胞超微结构、蛋白表达等方面进行了研究,结果表明,乙酸(钠)作用于重组菌后,可使其生长受到抑制,且随浓度的不同而发生变化;细胞膜的通透性会有所增加,细胞膜的完整性及膜的结构受到破坏,导致部分细胞内容物发生泄露;菌体正常形态发生变化;重组海藻糖合酶的表达受到影响。


高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——摘要

高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——材料与方法

高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——结果

高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——讨论、结论

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