3、讨论
在利用重组大肠杆菌进行高密度发酵的过程中，发酵液中会有代谢副产物乙酸的积累，乙酸的存在抑制工程菌的生长及外源基因的表达。乙酸对重组大肠杆菌的抑制作用已有报道，本研究根据实验中出现的这一现象，进行了更加深入的理论基础研究，对乙酸的抑制作用机理进行了探讨。
研究中发现，在加入乙酸钠的环境中，菌体会出现一定的适应期，较低浓度（0.5、1和2 g/L）的乙酸钠对菌体影响较小，并且可能是由于质子化的乙酸根进入细胞后，可以作为碳源参与到细胞内的代谢中，供菌体生长所用，所以会对菌体生长稍有促进；而在较高乙酸钠浓度下，菌体细胞或其代谢过程可能会被破坏，因而菌体生长受到严重抑制。本研究首先研究了乙酸、乙酸钠对重组大肠杆菌细胞形态及显微特征的影响，发现菌体会发生皱缩或者凹陷，有些菌体周围可以看出类似发生了内容物的外泄，这可能是由于乙酸、乙酸钠引起了菌体细胞膜的破坏，进而导致了菌体形态的变化甚至内容物的外泄。
根据上述现象，通过实验进一步研究了乙酸、乙酸钠对于菌体细胞膜的影响，细菌的细胞膜具有一定的流动性，当细菌细胞膜遭到破坏，使得其半透性及流动性降低时，细胞的内环境稳定性会被破坏，从而导致内部的电解质（如K+）外渗，培养液的电导率上升。细菌细胞膜是细菌的结构组分，不仅是细胞的保护屏障，也是在细胞的生命活动中有着复杂功能的重要结构。当细胞膜遭到破坏时，首先细胞内的小分子物质外渗出来，然后是DNA和RNA等一些大分子的外渗，而DNA和RNA在260 nm处有强吸收，因此，对260 nm吸收物质的检测被广泛应用于测定细胞膜的完整性。测定处理后菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化，通过测定处理后菌液上清在260 nm处的吸光度值变化推测菌体细胞膜的完整性变化，而这两个实验结果比较复杂，分析可能涉及到乙酸、乙酸钠的解离和水解问题，但结果说明菌体细胞膜的通透性与完整性都会受到一定的影响。
细菌在受到乳糖诱导后均可产生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶是位于细胞内的水解酶，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）是乳糖的类似物，β-半乳糖苷酶可以将ONPG水解成半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚，因此可以通过颜色的变化测知β-半乳糖苷酶的活性。实验通过测定菌液上清中的β-半乳糖苷酶的活性，来检测胞内大分子渗透至胞外的情况，进而说明细胞内膜的受损情况，不同浓度的乙酸钠对其作用后会有影响，但差别较小。
蛋白质分子中因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等氨基酸残基而产生内源性荧光。在大多数情况下，可以认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基，其变化直接反映了蛋白质中色氨酸残基本身及其周围环境的变化。当某些小分子如药物等物质与蛋白质结合时，导致其荧光强度下降，称为荧光淬灭作用。根据Trp的激发波长Ex，固定Ex，通过日立F-4500荧光分光光度计在310-450 nm范围内扫描即可确定Trp在重组大肠杆菌膜蛋白中的发射波长Em。
为了确定Trp在重组大肠杆菌膜中的位置，需要将猝灭剂KI（1 mol/L）稀释成不同浓度（0、0.01、0.02、0.05和0.1 mol/L）加入，检测对Trp发射波长Em的峰位和峰高的影响。如果Em迅速降低，则表明该氨基酸残基位于表面，如果Em变化不大，则表明该氨基酸残基位于膜内，如果Em逐渐降低，就表明该氨基酸残基的位置有两种可能，可能是在膜内也有可能是在膜外。结果表明乙酸能够改变细胞膜的结构，使位于细胞膜内的Trp残基暴露于细胞膜外。这个结论比较明确地说明了乙酸会对细胞膜产生影响，进而影响其功能。
在研究乙酸钠对蛋白合成的影响时，可以看到明显的趋势，低浓度下乙酸钠的添加会促进海藻糖合酶的表达量，而高浓度的乙酸钠又会起到抑制作用。其原因可能是乙酸根会影响DNA的复制或表达，也可能是乙酸钠使菌体细胞膜受到损坏，导致一部分酶发生了外泄造成的。
在研究过程中，采用的是菌液中外源添加乙酸、乙酸钠的方法，由于乙酸在溶液中的存在形式有乙酸分子形式及乙酸根形式，则试验中分别对两种形式进行了研究，添加乙酸、乙酸钠至所需的浓度后，菌液的pH变化与对照组相差较小，因此主要考虑了乙酸、乙酸根的影响。
据已有的研究表明，某些抑菌剂可与细菌染色体DNA发生相互作用，导致DNA的复制、转录以及表达受到抑制。本试验中乙酸会影响海藻糖合酶的表达量，这可能是由于乙酸对胞内DNA、RNA等产生抑制作用直接影响其表达量，也可能是由于随着乙酸浓度的增大，重组菌细胞的通透性、结构等发生变化，导致部分蛋白发生泄露，因而影响了目的蛋白的含量。具体的机制还需要今后做进一步研究，进行验证。
4、结论
根据发酵过程中的检测初步研究了乙酸（钠）对重组大肠杆菌的抑制作用及部分作用机理。通过外源添加乙酸（钠）的方法，对重组菌的生长曲线、细胞膜通透性、细胞膜结构、细胞超微结构、蛋白表达等方面进行了研究，结果表明，乙酸（钠）作用于重组菌后，可使其生长受到抑制，且随浓度的不同而发生变化；细胞膜的通透性会有所增加，细胞膜的完整性及膜的结构受到破坏，导致部分细胞内容物发生泄露；菌体正常形态发生变化；重组海藻糖合酶的表达受到影响。
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——摘要
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——材料与方法
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——结果
高密度发酵的过程中乙酸抑制重组大肠杆菌生长及外源基因的表达——讨论、结论
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