本文通过重叠PCR技术构建获得枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）来源的谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）（BTG）重组基因Sprodbtg，该基因依次包含SD序列、谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949序列、proD-BTG基因，并将该目的基因克隆入大肠杆菌~谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pXMJ19中构建重组质粒pXMJ19-Sprodbtg.随后，重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032中进行诱导表达，并对重组菌株的诱导条件进行优化。结果表明：重组菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表达重组酶原蛋白proD-BTG经活化后，BTG的活力达到（41.23±2.01）U/L；在重组菌培养12 h后诱导、IPTG终浓度0.8 mmol/L、诱导40 h的最优诱导条件下，BTG的活力达到最高，为（55.62±2.34）U/L，较优化前提高了约34.90%。
谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）是一种催化酰基转移反应的转移酶，催化蛋白质分子内和分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应。由于其安全、特有的交联性质，可用于改善蛋白质的结构和功能性质，在植物蛋白制品、焙烤制品、鱼、肉、乳类制品、固定化酶、可食性包装等行业已有广泛应用。
目前，仅茂源链霉菌（Streptomyces mobaraense）谷氨酰胺转氨酶（MTG）实现了商业化生产，但茂源链霉菌生长慢、发酵周期长、酶活力收率低，造成MTG价格较高；另外，随着食品加工业种类逐渐增多，MTG的特性无法满足一些食品加工底物和过程的需求，因此，亟需开发不同特性的TG.枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）谷氨酰胺转氨酶（BTG）是在1996年被Kobayashi等首次发现，且经验证BTG的分子结构没有信号肽和前肽；Suzuki等发现BTG最适作用pH为8.2，最适作用温度为60℃，可催化酪素液及BSA蛋白分子的凝胶化和交联；并且，经分析BTG和MTG在氨基酸序列和空间结构上有很大区别，这为开发新型TG奠定了基础。
本研究室在前期研究中从枯草芽胞杆菌（B.subtilis）168ATCC23857基因组克隆了BTG基因，该基因仅编码成熟肽，对异源宿主细胞有毒性，影响其正常生长，难以实现BTG高效表达。研究发现，来自于生暗灰链霉菌（S.caniferus）的TG前肽proD对BTG活性的抑制率最高，达到70%.然而，大肠杆菌表达系统难以实现proD-BTG酶原的高效表达。谷氨酸棒状杆菌蛋白分泌机制健全，生长迅速，培养简便，使用安全，无致病性，是表达外源基因的良好受体菌，本研究室已利用谷氨酸棒杆菌表达系统实现了BTG的异源表达。因此，基于上述研究，本文以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032为宿主菌株，构建重组菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg以实现proD-BTG的高效分泌表达，并对其诱导条件进行优化，旨在为BTG的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒
大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、谷氨酸棒状杆菌（C.glutamicum）ATCC13032、大肠杆菌~谷氨酸棒杆菌穿梭表达质粒pXMJ19和克隆有prodbtg基因的质粒pET28a-prodbtg均为本实验室保藏。
1.1.2酶与主要试剂
限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ、T4 DNA连接酶、Probest高保真酶，TaKaRa公司；溶菌酶、RNase，上海生工生物工程有限公司；小量琼脂糖凝胶DNA试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；BCA蛋白浓度试剂盒，碧云天生物技术研究所；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；Factor Xa，Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3培养基
LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，pH 7.0.
LA培养基：LB+2%,琼脂粉，pH 7.0——7.2.
谷氨酸棒杆菌复苏培养基：LB+0.5%,葡萄糖，pH 7.0——7.2.
谷氨酸棒杆菌产MTG培养基（MMTG）（g/L）：葡萄糖60，MgSO41，（NH4）2SO430，KH2PO41.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，盐酸硫胺素4.5×10-4，生物素4.5×10-4，甲硫氨酸0.15，CaCO350，pH 7.5.
1.1.4引物设计
为了使得外源蛋白在谷氨酸棒状杆菌中实现高效分泌表达，设计含SD序列及C.glutamicum R来源的有高效分泌能力信号肽ΔS0949序列的重组proD-BTG基因序列。依据引物设计原则设计引物。上游引物P1：5′~TATCGGCGCTGCCAGCATGT TTATGCCAAAGGCCAACGCCCAAGGAGCACTCG AGGCCAGCGGCGGC-3′；P2：5′~CCCAAGCTT AAA GGAGGACACGCATGCAAATAAACCGCCGAGGCT TCTTAAAAGCCACCGCAGGACTTGCCACTATCG GCGCTGCCAGCATG-3′；下游引物R1：5′~CGCGG ATCC TTAGCGGACGATGCGG-3′。上游引物P15′端不含有酶切位点；上游引物P25′端含有HindⅢ酶切位点（AAGCTT）；下游引物R15′端含有BamHⅠ酶切位点（GGATCC）。
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