目前对畜禽粪便的处理主要包括物理法、化学法和生物法三大类。生物发酵处理法是近年来国内外研究较多的一种方法。该法具有成本低、发酵产物生物活性强、肥效高、易于推广等特点,同时可达到除臭、灭菌的目的,因而被认为是最有前途的一种畜禽粪便处理方法。在固体发酵畜禽粪便过程中,由于废弃物中含有大量纤维素,因此,加强纤维转化为腐殖质便成为发酵充分腐熟的关键。微生物是产生纤维素酶的主要来源,在发酵的过程中发挥了巨大的作用。细菌、放线菌和霉菌都能够产生纤维素分解酶,常作为接种剂加速粪肥等物料细胞壁和木质素、纤维素水解,促进腐殖化过程。其中分解纤维素的真菌主要有曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)和镰刀菌属(Fusarium)的一些种。在发酵过程中,真菌对发酵物料的分解和稳定起着重要作用。本研究从采集的畜禽粪便和土样中,对纤维素分解菌进行了筛选,同时对筛选出的纤维素分解菌与解磷巨大芽孢杆菌、细黄链霉菌等组合形成复合菌剂(另文发表)在粪便堆积发酵中最佳生长条件进行研究,旨在筛选出具有高酶活的纤维素分解菌并形成高效复合菌剂,加快纤维素的降解,提高粪肥堆积发酵速度与质量。
1 材料与方法
1.1 材料
省内采集的畜禽粪便和土样共计7个,用于纤维素分解菌的筛选。发酵试验用牛粪取自黑龙江省发酵工程技术中心。经成分分析:牛粪全氮含量为1.18﹪,全磷含量为0.48%,有机质(干基)38.5%,水分75.7%。复合菌剂由筛选出的纤维素分解菌和解磷巨大芽孢杆菌、细黄链霉菌等复合形成,本所生产。
1.2 培养基
羧甲基纤维素培养基:CMC-Na 15g,NH4NO31.0g,酵母膏1.0g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO4·3H2O 1.0g,H2O 1000mL,pH自然,琼脂15g,121℃、30min蒸汽灭菌。
赫奇逊培养基:KH2PO4·3H2O 1.0g,MgSO4·7H2O 0.3g,CaCl20.1g,NaCl 0.1g,FeCl30.01g,NaNO32.5g,H2O 1000 mL,pH 7.0,121℃、30min蒸汽灭菌。
纤维素刚果红培养基:KH2PO4·3H2O 0.5g,MgSO4· 7H2O 0.25g,微晶纤维素1.88g,明胶2g,刚果红0.2g,土壤浸出液100 mL,H2O 900 mL,琼脂15g,pH 6.5,121℃、30min蒸汽灭菌。
纤维素琼脂培养基:(NH4)2NO32g,MgSO4·7H2O 1.0g,CaCO32g,NaCl 1.0g,H2O 1000 mL,琼脂15g,pH 7.0,121℃、30min蒸汽灭菌。
纯化培养基(PDA培养基):马铃薯汁20%,蔗糖20g,琼脂15g,水1000 mL,121℃、30min蒸汽灭菌。
固体曲培养基:无霉变米糠粉、麸皮(过60目筛),加适量无菌水,调节水分至50%左右,pH自然,121℃、60min蒸汽灭菌。
察氏培养基:蔗糖3.0g,NaNO33.0g,MgSO4· 7H2O 0.5g,KCl 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,K2HPO41.0g,琼脂15.0g,H2O1000 ml,pH自然。
1.3 方法
1.3.1 纤维素分解菌的分离与纯化(初筛)
将样品采用“弹土法”点接于羧甲基纤维素培养基平板上,置28℃培养,挑选出在平板上生长快、透明圈大的培养物;将样品稀释到适宜程度(一般情况下10-1~10-3),吸取1mL稀释液,用纤维素刚果红培养基制成混菌平板,置28℃培养,挑选出在平板上生长快、红色浓郁且水解圈大的培养物;将样品接种于内放滤纸条的赫奇逊培养液中,置28℃培养5~7d,挑选出将滤纸条分解断裂快的培养物。
将挑选出的以上培养物在PDA培养基上多次划线和用稀释平板法筛选出单个菌落,结合镜检,反复多次,直至纯化为单菌株。
1.3.2 不同菌株对滤纸分解能力的测定(复筛)
采用滤纸失重率法:将选出的菌株单株或混合株分别接种于以滤纸为唯一碳源的选择性培养基中,28℃、120r/min摇床培养,观察滤纸的崩解效果,以“+”的多少来表示滤纸崩解程度,“+”越多,说明该菌株的降解效果越强。
用滤纸过滤发酵液,将残留物80℃烘干称重,用减重法计算出滤纸失重率。
计算公式:滤纸失重率S(%)=(A-B)/A× 100%
其中:A-初始滤纸重,gB-残留滤纸重,g。1.3.3不同菌株对羧甲基纤维素分解能力的测定(复筛)
将分离的单个菌株及其混合菌分别点种于羧甲基纤维素培养基平板上,28℃培养3d,测透明圈直径。并计算酶相对活性:
式中:A为相对活性;d为透明圈直径;t为培养时间。