【摘要】目的评估两株流感H10亚型重配病毒在不同细胞内的生长特性，筛选可用于疫苗生产的细胞。方法基于A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)病毒的表面基因，利用反向遗传技术构建以高产PR8病毒为骨架的RG-H10N8(6+2)和RG-H10N1(7+1)两种重配病毒，在SPF鸡胚增殖病毒后，经序列测定确认，以质粒拯救RG-PR8病毒为对照，比较病毒在MDCK和Vero细胞上的生长敏感性；以相同MOI感染MDCK细胞后，比较病毒的生长特性。结果两种流感H10重配病毒和RG-PR8病毒在MDCK细胞上均能检测到病毒滴度，但是在Vero细胞上，RG-H10N8检测不到病毒滴度，RG-H10N1和RG-PR8可以检测到病毒滴度；用相同的MOI感染MDCK细胞后，RG-PR8生长能力强于两种重配病毒，两种重配病毒间差异不大。结论两种流感H10重配病毒在MDCK细胞上生长能力较好，MDCK较Vero细胞对H10重配病毒更敏感，来源不同的NA会影响病毒在Vero细胞上的生长敏感性。
流感病毒在人群可造成季节性流感或流感大流行，接种疫苗是预防流感最有效的途径。由于流感病毒容易变异，因此世界卫生组织每年组织疫苗推荐会，以确定新的季节性流感疫苗株，同时筛选可能会造成流感大流行的动物源性流感病毒疫苗株。为了快速获得有效高产的疫苗株，需要构建含有表面蛋白HA和NA，内部基因来源于经实验室长期筛选的在鸡胚中高产并减毒的A/PR/8/34(H1N1)(简称PR8)毒株，即6+2重配策略，或仅替换表面HA基因，其余基因均使用PR8，即7+1重配。构建重配病毒的方法包括经典重配和反向遗传技术，后者能够快速获得重配疫苗株。2013年我国首次发现人感染H10N8禽流感病例，并在同一地区又接连发生两例病例，在随后的流行病学调查中发现，该病毒来源于活禽市场，因此快速获得H10N8流感疫苗株是防控的重要手段。
本研究利用反向遗传技术，构建了两种不同基因构成的H10亚型重配病毒，两种病毒分别感染MDCK和Vero细胞，比较病毒在两种细胞上的生长敏感性，以及在敏感细胞上的生长特性，筛选出更适于病毒生长的细胞系，为未来生产细胞基质疫苗奠定基础。
1材料与方法
1.1细胞和病毒
MDCK和Vero细胞由国家流感中心保存，野生型病毒A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)(简称JX346)分离自首例人感染H10N8病例，由国家流感中心分离并保存。
1.2重配病毒的构建
利用国家流感中心反向遗传技术平台系统中的A/PR/8/34(简称PR8)骨架质粒系统，按照之前发表的拯救方法构建重配病毒；同时制备重配的PR8病毒作为对照病毒；以上病毒均经SPF鸡胚传代扩增一次用于本实验。
1.3序列测定与分析为确认两株H10重配病毒HA和NA基因来源，将病毒按照国家流感中心标准操作规程，使用德国Qiagen公司的RNeasy Mini Kit(74106)提取核酸RNA，使用科室引物库中两端带有M13序列的正反向引物，用德国Qiagen公司one-step RT-PCR kit(210212)扩增HA和NA基因，扩增后基因经Affymetrix公司的USB PCR产物纯化酶纯化后，使用3730xl测序仪测序，使用Lasergene(Version 7.1.0)软件拼接，使用BioEdit(Version 7.1.3.0)分析序列。
1.4病毒滴度测定
1.4.1细胞组织中病毒滴度测定：于96孔板中制备单层细胞，每孔100μl PBS洗两次，将病毒稀释液以每孔100μl接种于细胞上，每稀释度4个复孔，置37℃的5%C02培养箱吸附1 h，弃病毒感染液，PBS洗两次；每孔加100μl病毒维持液，继续培养72 h，观察CPE并取上清作HA血凝实验。
1.4.2鸡胚组织中病毒滴度测定：将病毒做稀释，以每稀释度100μl l接种4枚鸡胚，35℃培养48h后收尿囊液作HA血凝实验；HA血凝实验用1%豚鼠红细胞测定，结果按Reed—Muench方法计算TCID50和EID50。
1.5生长曲线测定
将病毒分别以MOI=0.1，0.01和0.001感染细胞，在感染后24 h、48 h和72 h分别收取感染细胞上清后，放置在微生物生长曲线分析仪中，设置为-80℃保存，所有样本统一解冻后用1%豚鼠红细胞测定HA血凝滴度，根据HA结果绘制生长曲线。