研究探讨了Toll/interleukin-1 receptor（TIR）结构域含有的蛋白质在免疫反应中的重要性，尤其是在细菌对噬菌体的防御机制中。TIR结构域广泛存在于多种生物体中，包括哺乳动物、植物和细菌，参与病原体识别和免疫信号传导。然而在细菌系统中，TIR结构域的具体功能尚未得到充分阐明。研究者们特别关注大肠杆菌（Escherichia coli），通过对NCBI数据库中所有可用的大肠杆菌基因组进行全面调查，识别出781种含有TIR结构域的蛋白质，并进一步分析其在细菌免疫中的作用。研究发现37.5%的TIR结构域含有的蛋白质展现出抗噬菌体活性，这一发现揭示了细菌利用TIR系统进行免疫防御的潜力。本研究认为TIR结构域的防御机制与哺乳动物的Toll样受体（TLRs）具有相似之处，后者通过识别病原体相关分子模式（PAMPs）来启动免疫反应。这种相似性不仅丰富了研究人员对细菌免疫机制的理解，也突显了在进化过程中，细菌如何发展出复杂的防御策略以应对噬菌体的攻击。尽管已识别出多种TIR结构域含有的防御系统，但仍有许多蛋白质的具体功能尚未明确。了解这些蛋白质如何识别和响应噬菌体的特定成分，对于揭示细菌的免疫机制至关重要。通过系统性地探索大肠杆菌中的TIR防御系统，研究人员希望填补这一知识空白，并为未来的研究提供基础。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
将表达特定防御系统的大肠杆菌细胞过夜培养物接种到补充有50µg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，并在37°C下以200 rpm的振荡速度孵育。含有空质粒的大肠杆菌细胞用作对照。当细胞密度达到OD600 0.3时，将180µL培养物转移至100孔板的每个微孔中，其中含有20µL 10倍连续稀释的噬菌体。将板立即置于Bioscreen C自动生长曲线分析系统上。培养物保持在37°C，持续振荡，每5或10分钟测量一次OD600，总持续时间为3小时。研究人员利用Bioscreen系统来测定不同TIR防御系统在大肠杆菌中表达时对噬菌体感染的反应。通过测量细菌的吸光度（OD600），可以了解噬菌体感染对细菌生长的影响，以及TIR系统是否有效抑制了噬菌体的增殖。
实验结果
研究发现，在大肠杆菌中，37.5%的TIR结构域含有的蛋白质展现出抗噬菌体活性。这表明TIR结构域在细菌免疫防御中发挥了重要作用。TIR系统能够识别多种噬菌体成分，提供了一种复杂的机制用于病原体检测和防御。这种识别能力与哺乳动物的Toll样受体（TLRs）相似，表明细菌和哺乳动物在免疫机制上存在进化上的平行。研究识别了12种新的TIR防御系统，这些系统在对不同噬菌体的防御中表现出不同的活性。这种多样性可能是细菌在与噬菌体的进化斗争中形成的强大防御网络的一部分。
图1、筛选包含TIR结构域的候选抗噬菌体防御系统。a）用于从NCBI数据库中提供的所有大肠杆菌基因组中识别包含TIR域的候选系统的流程图。b）64个TIR候选防御系统的轨迹架构。条形图显示了已测序的大肠杆菌基因组中每个簇的成员。以蓝色突出显示的集群表示本研究中克隆的32个TIR系统。结构域：RT逆转录酶、功能未知的DUF结构域、TPR四肽重复序列、TM跨膜。
图2、大肠杆菌中12个具有TIR结构域的抗噬菌体系统的鉴定。a）显示了每个系统的域组织，并使用大肠杆菌MG1655针对111种不同噬菌体一式三份测定了它们的防御活性，如方法中所述。颜色表示EOP实验中每个TIR系统针对每个噬菌体的代表性结果的EOP减少倍数。条形图显示每个系统中限制的噬菌体数量。b）防御系统的基本域架构和突变分析。
图3、大肠杆菌TIR系统的广泛识别谱。a)用于分离克服TIR防御系统的突变噬菌体的管道。含有单一TIR防御系统的大肠杆菌MG1655细胞被噬菌体感染。含有空载体的大肠杆菌MG1655细胞用作对照。b)鉴定逃逸噬菌体中的突变基因。灰色块表明没有分离出逃逸的噬菌体。每个栗色块中的四角星和五角星表示突变基因的身份，如右侧所示。c)对TIR系统敏感的基因的示意图，涵盖噬菌体复制的不同阶段。d–g)TIR系统敏感基因在相应TIR系统存在下的毒性。通过添加阿拉伯糖诱导蛋白质表达。缺乏TIR系统的空载体用作阴性对照。突变基因用于确定突变蛋白是否可以赋予噬菌体对TIR系统的抗性。
图4、单个TIR防御系统可能对不同噬菌体的相同成分敏感。a–c噬菌斑测定表明，TIR-IV(a)、TIR-Retron(b)和Thoeris-II(c)系统分别对不同噬菌体的主要衣壳蛋白、DNA引物酶解旋酶和尾部蛋白敏感。缺乏TIR系统的空载体用作阴性对照。使用十倍系列稀释的噬菌体进行感染。蛋白质中的突变位点用黑色箭头表示。d噬菌体#41和#45主要衣壳蛋白的结构分析。使用AlphaFold2对结构进行建模并使用PyMOL进行分析。突变位点以红色突出显示。e纯化的WT和逃逸的噬菌体病毒粒子的电子显微照片。测定一式三份进行并显示了代表性结果。f)表达灭活TIR-IV突变体的大肠杆菌MG1655上的WT（绿线）和逃逸噬菌体（蓝线）#45、#41、#75和#106的感染动力学。g)WT和逃逸噬菌体#45、#41、#75和#106在大肠杆菌MG1655上的一步生长曲线。
图5、不同的TIR防御系统可能对不同噬菌体的相同成分敏感。a、b噬斑测定表明TIR-V(a)和TIR-IX(b)系统分别对噬菌体#20和#70的门蛋白敏感。缺乏TIR系统的空载体用作阴性对照。使用十倍系列稀释的噬菌体进行感染。蛋白质中的突变位点用黑色箭头表示。c）该图显示TIR-V和门蛋白表达质粒的共转化导致转座酶S1/S4插入破坏TIR-V系统。直方图显示，在TIR-V系统存在下，门蛋白表达质粒的转化效率显着降低。数据以三个生物重复的平均值表示。d）噬菌斑测定表明，TIR-V的抗噬菌体活性被转座酶S1/S4插入消除。e）在TIR-IX系统存在下，噬菌体#70的WT门蛋白的毒性。f,g）T7噬菌体门户蛋白可以激活TIR-V，但不能激活TIR-IX系统(f)，而T4噬菌体门户蛋白可以激活两者(g)。h,i噬菌体T7（深黄色）、#20（紫色）、T4（淡紫色）和#70（青色）的门户蛋白的结构分析。j）TIR-V和TIR-IX蛋白的结构和保守性分析。
总结
含有Toll/白细胞介素1受体(TIR)结构域的蛋白质在多种生物体的免疫反应中发挥着关键作用，但它们在细菌系统中的功能仍有待充分阐明。本研究以大肠杆菌为重点，探讨了含有TIR结构域的蛋白质如何促进细菌对噬菌体攻击的免疫。通过对NCBI数据库中提供的所有大肠杆菌基因组进行详尽的调查，并对90%已识别的含有TIR结构域的蛋白质中的32个代表进行测试，研究发现很大一部分(37.5%)表现出抗噬菌体活性。这些防御系统可识别各种噬菌体成分，从而为病原体检测和防御提供复杂的机制。在噬菌体逃逸突变体的选择过程中，Bioscreen全自动生长曲线分析仪用于快速筛选和鉴定那些能够逃避TIR防御系统的噬菌体。通过连续监测细菌培养的生长情况，研究人员可以识别出在TIR防御系统存在下仍能生长的噬菌体，这些噬菌体可能是通过突变获得了逃避TIR系统的能力。这项研究不仅强调了TIR系统在细菌免疫中的稳健性，而且还与哺乳动物Toll样受体(TLR)的多样性进行了有趣的相似，丰富了人们对跨生命形式的先天免疫机制的理解，并强调了细菌免疫的进化意义。原核生物中的这些防御策略。本研究丰富了对细菌防御机制复杂性质的理解，特别是大肠杆菌。本研究结果为理解TIR系统在细菌免疫中的作用奠定了基础，但它们也强调需要进行更详细的研究，以充分阐明这些系统的复杂性。从这项研究中获得的见解不仅增进了我们在微生物学方面的知识，而且为医学和生物技术的创新应用铺平了道路。
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