乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异—

乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——材料与方法

来源：农业生物技术学报发布时间:2024-12-11 15:37:58 浏览：40 次

1材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株、质粒及细胞

rSA14：SA14株病毒的感染性克隆株，rJEVEI176R：rSA14株病毒的E蛋白176位点突变为R的毒株，2株病毒均由四川农业大学动物医学院猪病研究中心周于用硕士构建保存(Zhou et al.,2018b)。JEV感染性克隆质粒(pACYC-JEV-SA14/U14163)由中科院武汉病毒研究所张波研究员赠送。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞购自擎科生物科技有限公司(北京)。非洲绿猴肾细胞(Vero)、人星形胶质细胞(U-251)、小鼠小胶质细胞(BV-2)、仓鼠肾细胞(BHK-21)均购自美国菌种保藏中心。

1.1.2主要试剂

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Easer、2×PrimeSTAR Max Premix、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程有限公司(大连)；qPCR SYBR MasterMix购自翊圣生物科技有限公司(上海)；2×Seam‐less Cloning Mix购自博迈德基因技术有限公司(北京)；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG购自博士德生物工程有限公司(武汉)；DMEM、胎牛血清购自Gbico公司(美国)；E蛋白多克隆抗体(工作浓度为1∶500,50 kD)和NS3蛋白多克隆抗体(工作浓度为1∶200,64 kD)均由本实验室制备保存，GAPDH抗体(工作浓度1∶5000,37 kD)购自三鹰生物技术有限公司(武汉)，ColorMixed Protein Marker 180(10~180 kD)购自爱博泰克生物(武汉)。

1.2方法

1.2.1 rJEV-EI176R毒株E基因扩增

分别取500μL病毒液按病毒RNA快速抽提试剂盒说明书(生工生物工程有限公司,上海)进行操作得到RNA，随后反转录得到cDNA。根据NCBI数据库中JEV SA14毒株E基因序列(GenBank No.U14163.1)，使用CE Design V1.04设计扩增E基因引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以cDNA为模板，PCR扩增E基因片段的反应体系(25μL)：cDNA 2μL，PrimeSTAR Max DNA Poly‐merase 12.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，ddH2O补足25μL。PCR反应程序：98℃3 min；98℃20 s，55℃30 s，72℃20 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 rJEV-EI176R的生物信息学分析

将1.2.1扩增出来的PCR产物送至生工生物工程有限公司(上海)进行测序，并使用DNAMAN 6软件进行序列比对。运用SOPMA在线预测工具对蛋白二级结构进行预测分析。利用ExPASy ProtParam tool在线分析软件对E基因翻译后的氨基酸序列进行分析。利用Pymol2.3作图展示蛋白的176位点的不同氢键连接方式。同时利用PolyPhen 2预测蛋白质突变的性质。

1.2.3 rJEV-EI176R病毒株生长特性测定

1.2.3.1荧光定量标准曲线的建立

用质粒PIRES2-EGFP-E做标准品，用分光光度计测量浓度后，依次按10倍梯度稀释用作模板。按照引物设计原则，使用NCBI在线设计E基因的荧光定量引物(表1)，以GAPDH为内参基因，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qP‐CR反应体系20μL：10μL SYBR Green Mix，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，模板1μL，8.2μLddH2O。使用实时荧光定量PCR仪(Roche,瑞士)进行检测，反应程序：95℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，共40个循环。

1.2.3.2生长曲线测定

BV-2细胞接种T75细胞瓶，待细胞铺满单层后，将JEV rSA14和rJEV-EI176R病毒株以相同感染复数(MOI=0.01)分别接种细胞，设置3个重复，37℃培养箱中孵育1.5 h，弃去病毒液，加入20 mLDMEM(2%FBS)维持液，于感染后0、12、24、36、48、60和72 h收集500μL细胞上清液，运用bioscreen生长曲线分析仪测定病毒E基因拷贝数，绘制病毒生长曲线，比较突变株、亲本株病毒在BV-2细胞上的生长特性差异。

1.2.3.3蚀斑试验

将BHK-21细胞铺至6孔板中，待孔中细胞融合度达到90%时进行病毒液接种。将JEV rSA14和rJEV-EI176R病毒液按10倍梯度依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，并用PBS将孔中细胞润洗3次后接种10-4、10-5和10-6病毒混悬液，每孔200μL剂量，37℃培养1.5 h后弃去病毒混悬液，加入1.25%的甲基纤维素，于37℃培养箱放置4 d后用结晶紫染色20~30 min，用自来水轻轻冲去染液便可观察空斑大小。

1.2.3.4 rJEV-EI176R病毒株在细胞上的增殖试验取无菌爬片依次放入12孔细胞培养板中，接种细胞，待细胞长成均匀的单层后，将突变株、亲本株病毒以相同的感染复数(MOI=1)分别接种BV-2细胞，设置3个复孔，阴性对照不加病毒。分别于感染后48 h弃去培养液，用预冷的PBS洗涤3次后用4%的多聚甲醛固定0.5 h，再用PBS洗涤3次，用0.1%的曲拉通-100通透0.5 h后用PBS洗涤3次，再用IFA封闭液封闭2 h，加入500μL NS3蛋白多克隆抗体，4℃孵育过夜。用Tris-HCl+Tween缓冲盐溶液(tris-buffered saline and tween 20,TBST)洗涤后，加入500μL异硫氰酸荧光素(fluorescein iso‐thiocyanate isomer,FITC)标记的羊抗兔二抗孵育40 min，PBS洗涤4次，每次5 min。最后运用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料对细胞核进行染色，用无色指甲油进行封片。完成后，运用奥林巴斯BX63荧光显微镜拍照观察。

1.2.3.5 rJEV-EI176R病毒对细胞的吸附试验

BV-2细胞、U-251细胞、Vero细胞和BHK-21细胞接种6孔细胞培养板，待细胞长满单层后，突变株与亲本株病毒以相同的感染复数(MOI=10)分别接种于细胞，设置3个复孔，在4℃孵育1 h，用PBS洗去未吸附的病毒，提取细胞总RNA后反转录成cDNA。按照引物设计原则，使用NCBI在线设计E基因的荧光定量引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以GAPDH为内参基因，qPCR反应体系20μL：10μL SYBR Green Mix，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，模板1μL，8.2μLddH2O。反应程序：95℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，共40个循环。

1.2.4 rJEV-EI176R病毒诱导BV-2细胞炎性水平差异检测

生长状态良好的BV-2细胞生长至80%~90%，分别感染突变株和亲本株病毒，感染后24 h收集样品，设置3个复孔。运用qPCR检测IL-6、TNF-α、IP-10细胞因子转录表达情况。引物信息见表1，以GAPDH为内参基因，用qPCR检测细胞因子转录的mRNA的水平，反应体系和反应程序同1.2.3。

1.2.5统计学分析

所有实验结果均由3次重复所得，采用Graph‐pad Prim 9.1软件对数据进行统计学分析和作图，采用t检验分析差异显著性。

乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——摘要、前言

乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——材料与方法

乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——结果与分析

乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——讨论、结论

乙脑病毒株囊膜蛋白I176R位点在BV-2细胞上的生长特性差异——材料与方法

相关新闻推荐